Proteínas recombinantes de Mycobacterium tuberculosis para auxílio diagnóstico da tuberculose

Abstract

Resumo: O presente trabalho teve por objetivo desenvolver reagentes de potencial auxílio diagnóstico de tuberculose, elaborados a partir de proteínas recombinantes obtidas por clonagem, expressão e purificação de antígenos de secreção de Mycobacterium tuberculosis. Para seleção de cepas que representassem a diversidade genética de linhagens circulantes de M. tuberculosis foi realizada a caracterização molecular, pela técnica de mixed-linker PCR DNA fingerprinting, de 62 isolados clínicos obtidos a partir de amostras de pacientes com diagnóstico de tuberculose, atendidos pelo Sistema Único de Saúde no Estado do Paraná. A análise demonstrou que o número de cópias do elemento de inserção IS6110, por isolado, variou de quatro a 13, com um número médio de 8,5. Não foram observados isolados com ausência de cópias do elemento IS6110. A análise filogenética agrupou os 62 isolados em três grupos distintos: o primeiro grupo com cinco cepas, o segundo com 19 e o terceiro, mais heterogêneo, com 38 isolados. Apenas dois isolados (3,2%) formaram um cluster, ou seja, apresentaram padrão de polimorfismo com similaridade maior que 95%. Tais achados sugerem um predomínio de desenvolvimento da doença por reativação da infecção latente em relação à transmissão exógena no Estado do Paraná. A partir destes resultados, foram selecionados três isolados, com baixa similaridade e representativos de cada genogrupo, para serem submetidos ao processo de clonagem molecular. Foram selecionados 25 genes codificantes de proteínas de secreção de M. tuberculosis em cultura, reconhecidamente envolvidas na produção de resposta imune celular ou humoral. Após amplificação por PCR, clonagem em sistema Gateway® e expressão em Escherichia coli, as proteínas expressas foram purificadas por cromatografia de afinidade a metais, eletroforese SDS-PAGE em gel preparativo, seguido de eletroeluição e remoção de endotoxinas com Triton X-114. Ao todo, sete proteínas recombinantes foram obtidas (ESAT-6, CFP10, TB10.3, TB10.4, MTSP11, MPT70, MPT83). A avaliação de resposta imune humoral às proteínas recombinantes produzidas foi realizada com testes ELISA. Todas as sete proteínas recombinantes avaliadas apresentaram valores de absorbância superiores ao nível de corte do controle negativo e de reação inespecífica. Destas, as proteínas recombinantes ESAT-6, TB10.3, MTSP11 e MP70 tiveram valores superiores à média do controle positivo. As proteínas MPT70 E MTSP11 foram as mais reativas com valores de absorbância em média três vezes superiores ao controle positivo. A resposta celular de reação de hipersensibilidade tardia em cobaios (Cavia porcellus) foi avaliada em comparação com o derivado protéico purificado (PPD) padrão. Todas as sete proteínas recombinantes testadas produziram reação positiva de enduração em teste intradérmico em cobaios previamente sensibilizados com M. tuberculosis. Quando aplicadas em conjunto, na concentração de 0,04 mg/mL, os resultados de intradermorreação em C. porcellus foram expressivamente superiores aos obtido pelo PPD padrão (p-valor=0,00386). De posse destes resultados são discutidas perspectivas de uso das proteínas recombinantes produzidas para auxílio diagnóstico da tuberculose.

Abstract: The present work had the objective of developing reagents with diagnostics potential of tuberculosis, prepared with recombinant proteins obtained by cloning, expression and purification of secreted antigen from Mycobacterium tuberculosis. For selection of strains representing the genetic diversity of circulating M. tuberculosis, a molecular haracterization was performed by the mixed-linker PCR DNA fingerprinting technique on 62 clinic isolates from samples of patients diagnosed with tuberculosis and admitted by SUS of Paraná State, Brazil (Brazilian Centralized Health Service System). The analysis demonstrated that the number of copies of the IS6110 sequence per isolates varied from four to 13 bands, with an average number of 8.5. Isolates with no copies of the IS6110 element were not observed. The phylogenetic analysis grouped the 62 isolates by similarity into three different groups: the first group contained five strains, the second 19 and the third, a more heterogeneous group, contained 38 isolates. Only two isolates (3.2%) formed a cluster, in other words, they presented a pattern of polymorphism with similarity above 95%. Such findings suggest that in the State of Paraná illness predominantly develops through reactivation of the latent infection as opposed to exogenous transmission. From these results, three isolates were selected with low similarity and representing each genogroup to be subjected to the molecular cloning process. A number of 25 protein-coding genes of M. tuberculosis secretion during culture, known to be involved in the production of cellular or humoral immune response were selected. After PCR amplification, Gateway® cloning system and expression in Escherichia coli, the expressed proteins were purified by metal ion affinity chromatography, analysed by SDS-PAGE followed by electroelution and endotoxin removal using Triton X-114. A total of seven recombinant proteins were obtained (ESAT-6, CFP10, TB10.3, TB10.4, MTSP11, MPT70, MPT83). The evaluation of humoral immune response to the produced recombinant protein was performed by ELISA test. All the recombinant proteins presented absorbance values above the negative and the nonspecific reactivity control. Four proteins (ESAT-6, TB10.3, MTSP11 and MP70) showed values above those of the average of positive control. MPT70 and MTSP11 were the most reactive proteins with values of absorbance three-fold higher than those observed for positive control. The cellular response of the delayed type hypersensibility reaction in guinea pigs (Cavia porcellus) was evaluated by comparing the gold standard purified protein derivative (PPD). All seven recombinant proteins tested produced positive induration reaction by intradermal injection tests in guinea pigs sensitized by M. tuberculosis beforehand. Combined in pool at a concentration of 0.04 mg/mL, the results of intradermoreaction in C. pocellus were expressively higher than those obtained by PPD gold standard (p-value=0.00386). Given these results, perspectives for the use of recombinant proteins for the diagnosis of tuberculosis are discussed.