Transformação genética de alface (Lactuca sativa L.), cultivar "Grand Rapids", via Agrobacterium tumefaciens, para melhoramento de tolerância ao estresse hídrico
Resumo
Resumo: A prolina é um osmoprotetor, que pode atuar na proteção de plantas contra condições ambientais que diminuem a disponibilidade de água, denominadas estresses hídricos. O gene P5CS codifica a enzima delta1-pirrolina-5-carboxilato sintetase (P5CS), que participa na rota de síntese de prolina e é inibida pelo produto final. Uma mutação neste gene interferiu no sítio alostérico da enzima, tornando-a insensível à inibição por retroalimentação por prolina. Desta maneira, plantas modificadas geneticamente podem acumular prolina, pois a síntese constante deste aminoácido, sem inibição, supera suas taxas de degradação, e assim tolerar condições de estresse hídrico. Portanto, foi nosso objetivo avaliar a tolerância de linhagens de alface transformadas para três tipos de estresse hídrico: alta temperatura, congelamento e alta concentração salina, os dois primeiros ainda não avaliados para respostas a prolina, de acordo com a literatura atual. Neste trabalho foram adaptados protocolos de cultivo in vitro e transformação de alface (Lactuca sativa L.) cultivar "Grand Rapids". O sistema de transformação escolhido foi o de co-cultivo com Agrobacteríum tumefadens. O plasmídeo recombinante (pBI-P5CS) contendo o gene P5CS mutado, foi utilizado para transformar o cultivar "Grand Rapids". Este plasmídeo também contém, ligados ao gene P5CS, os gene NPTII, que confere resistência à canamicina, e o gene UildA, codificante da enzima B-glucoronidase. As principais modificações nos protocolos de transformação e regeneração estão descritas a seguir. Aumentou-se o tempo de co-cultivo com Agrobacterium (em uma alta concentração celular). Maior pressão seletiva, em termos de maior concentração de antibióticos no protocolo modificado em relação aos protocolos originais, foi utilizada na seleção de transformantes e bactérias. Os propágulos potencialmente transgênicos foram testados para expressão do gene GUS. Após adaptações para ambientes com umidade do ar mais baixa, as plantas selecionadas foram transferidas do cultivo in vitro para vasos, para obtenção de sementes T1. Foram obtidas 18 linhagens de alfaces potencialmente transformadas com o plasmídeo recombinante pBI-P5CS, 15 das quais com quantidades suficientes de sementes para os experimentos de tolerância ao estresse hídrico e confirmação de presença e expressão do transgene. A análise dos dados mostrou que algumas linhagens de plantas transformadas são mais tolerantes à temperatura de congelamento, outras à alta temperatura e outras ao estresse salino do que as controle, provavelmente devido ao seu menor potencial osmótico para manter e buscar água e pela maior reserva de prolina, importante no processo de recuperação pós-estresse. Algumas linhagens também apresentaram tolerância para mais de uma condição estressante testada. Avaliações por PCR usando iniciadores específicos indicaram a presença do transgene P5CS nas linhagens transformadas, enquanto que a quantificação espectrofotométrica confirmou um maior acúmulo de prolina nestas linhagens, comparadas com plantas controle não transformadas. A análise dos dados mostrou ainda que esta linha de pesquisa é válida na busca de cultivares resistentes à geada na agricultura do sul do Brasil, para plantio em solos salinos, cultivo em ambientes. Finalmente, este trabalho faz parte de um projeto maior, que busca a obtenção de plantas transgênicas que acumulem prolina betaína, um osmoprotetor mais eficiente, a partir de estoques intracelulares maiores de prolina. Abstract: Proline is an osmoprotector that may act in plants' protection against ambient conditions- showing decreased water availability, called osmotic stress. P5CS gene codifies the enzyme delta1-pyrroiine-5-carboxyfate synthetase (P5CS), which participates- in proline synthesis pathway and is inhibited by final product. A mutation in this gene change the atosteric site of the enzyme- which became insensitive to feedback inhibition. Consequently, genetically modified plants can accumulate proline, because constant synthesis of this aminoacid, without inhibition, overcome degradation taxes. Our objective was to evaluate tolerance of transformed lettuce strains for three types Of osmotic stress: high temperature, freezing, and high saline concentration. We adapted in vitro culture and transformation protocols for lettuce (Lactuca sativa L.) c.v. Grand Rapids. The transformation system used was the co-culture with Agrobacterium tumefaciens harboring' the recombinant plasmid pBI-P5CS. This plasmid also contains nptll (resistance to kanamycinj and uildA B-glucoronidase) genes. Fifteen transgenic lettuce strains were obtained. Analysis of data showed that some strains are more tolerant to stress than control, probably because they have a smaller osmotic potential which helps the plant to keep and to search for more water. Proline accumulation could be important in recovering process after stress. Evaluations by PCR techniques using specific primers suggested the presence of P5CS transgene in transformed lettuce strains, while spectrophotometric quantification confirmed a greater proline accumulation in such strains, when compared to non transformed plants.
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