Study of porphyrins and heterodimers targeting ABCG2 transporter and development of a multiplexed flow cytometric approach for detection of anti SARS-CoV-2 IgG, IgM and IgA
Resumo
Resumo: O transportador ABCG2 possui papel central na resistência a múltiplas drogas, porém, nenhum inibidor específico de ABCG2 foi testado em ensaios clínicos. A família de transportadores ABC transporta uma grande variedade de substratos, mas fotossensibilizadores baseados em estruturas porfirínicas são reconhecidos exclusivamente por ABCG2. No capítulo 1 foi descrita pela primeira vez uma porfirina (4B) capaz de inibir o transportador ABCG2 e de ressensibilizar células resistentes in vitro. A inibição foi dependente do tempo de incubação e 4B não se comportou como substrato de ABCG2. A porfirina 4B demonstrou IC50 de 1.6 µM e tipo de inibição mista, independente do substrato. 4B inibiu a atividade ATPasica e aumentou a ligação do anticorpo conformacional 5D3. O ensaio de termo-estabilidade confirmou as alterações alostéricas na proteína desencadeadas pela ligação da porfirina. Simulações de dinâmica molecular revelaram um comportamento distinto entre porfirina 4B e o substrato Pheophorbide a. Pheophorbide a foi capaz de ligar-se em três regiões diferentes da proteína enquanto 4B apresentou apenas região de interação na proteína, apresentando forte interação iônica com aminoácido GLU446. A inibição foi seletiva já que não foi observada inibição em P-gP nem em MRP1. Porfirina 4B foi capaz de ressensibilizar células que superexpressam o transportador ABCG2. Estes achados reforçam a ideia de que substratos podem ser uma fonte privilegiada de estruturas para identificação de novos inibidores para transportadores ABC associados a resistência à múltiplas drogas. Baseados nos resultados mostrados no capítulo 1, outras macromoléculas foram sintetizadas para avaliar os efeitos de heterodímeros construídos a partir de moléculas conhecidamente bioativas. Quatro heterodimeros foram propostos, mas apenas dois foram sintetizados com sucesso (BODIPY-colesterol e Chalcona-colesterol). Resultados preliminares sugerem que BODIPY-colesterol não se comporta como substrato de ABCG2 e que o colesterol não alterou o efluxo de mitoxantrona e hoechst 33342 mediado por ABCG2. Por sua vez, o colesterol anula o efeito da chalcona já que o heterodimero chalcona-colesterol modificou o perfil inibitório quando comparado à chalcona sozinha. Estes resultados trazem novas ideias sobre o papel do colesterol sobre ABCG2. Esta tese foi desenvolvida num contexto de pandemia do COVID-19 que trouxe a necessidade urgente do desenvolvimento rápido de novas metodologias para detecção de anticorpos anti-SARS-CoV-2. No capítulo 3 está descrita uma estratégia inovadora para detecção simultânea das imunoglobulinas IgG, IgM e IgA em pacientes com COVID-19. A proteína Nucleopcapsídeo foi covalentemente ligada à superfície de beads funcionalizadas através do linker sulfo-SMCC. Anti - IgG BUV395, anti-IgM BB515, anti-IgA1/IgA2 biotinilado e streptavidina BV421 foram usados como anticorpos secundários. As condições de incubação e diluição do soro foram otimizadas para detecção de cada isotipo de anticorpo e o ensaio multiplex foi então desenvolvido. Este novo ensaio livre de células foi capaz de diferenciar de maneira eficiente amostras positivas e negativas para COVID-19. A detecção simultânea de IgG, IgM e IgA apresentou sensibilidade de 88.5 - 96.2% e especificidade de 100%. Esta estratégia nova abre um novo caminho para diagnósticos baseados em citometria de fluxo. Abstract: The ABCG2 transporter plays a pivotal role in multidrug resistance (MDR), however, none inhibitor selective toward ABCG2 was evaluated in clinical trials. Although ABC transporters actively extrude a wide variety of substrates, photodynamic therapeutic agents with porphyrinic scaffolds are exclusively transported by ABCG2. In Chapter 1, we described for the first time a porphyrin derivative (4B), which plays as inhibitor of ABCG2 and capable to overcome MDR in vitro. The inhibition was time-dependent and 4B was not itself transported by ABCG2. Independently of the substrate, the porphyrin 4B showed an IC50 value of 1.6 µM and a mixed type of inhibition. This compound inhibited the ATPase activity and increased the binding of the conformational-sensitive antibody 5D3. A thermostability assay confirmed allosteric protein changes triggered by the porphyrin. Long-timescale molecular dynamics simulations revealed a different behavior between the ABCG2 porphyrinic substrate pheophorbide a and the porphyrin 4B. Pheophorbide a was able to bind in three different protein sites. In contrast, 4B was able to bind in an unique protein site, showing a strong ionic interaction with GLU446. The inhibition was selective toward ABCG2, since no inhibition was observed for P-glycoprotein and MRP1. Finally, this compound successfully chemosensitized cells that overexpress ABCG2. These findings reinforce that substrates of ABC proteins may be a privileged source of chemical scaffolds for identification of new inhibitors of MDR-linked to ABC transporters. Based on Chapter 1 data, other macromolecules were synthesized and the biological effects evaluated against ABCG2 transporter. Based on known bioactive molecules, four heterodimers were proposed, however, only two were successfully synthesized (BODIPY - cholesterol and chalcone - cholesterol). The results suggest that cholesterol is not an ABCG2 substrate, since BODIPY - cholesterol was not transported by ABCG2. In addition, cholesterol alone does not affect the ABCG2-mediated transport of mitoxantrone and hoechst 33342. Interestingly, cholesterol abrogate the inhibitory effect of chalcone, since the chalcone - cholesterol modified the inhibition profile of chalcone alone. Those results provide new insights about the role of cholesterol on ABCG2 transporter. This thesis was developed during the pandemic of coronavirus disease 2019 (COVID-19). The pandemic brought the urgent necessity of the rapid development of assays for detection of antibodies anti-SARS-CoV-2. In Chapter 3, we described an innovative strategy for simultaneous detection of immunoglobulin G (IgG), IgM and IgA in COVID-19 patients. The SARS-CoV-2 nucleocapsid protein was covalently bound to functional beads surface applying sulfo-SMCC chemistry. BUV395 anti-IgG, BB515 anti-IgM, biotinylated anti-IgA1/IgA2 and BV421 streptavidin were used as fluorophore conjugated secondary antibodies. Serum and antibodies reaction conditions were optimized for each antibody isotype detection and a multiplexed detection assay was developed. This new cell-free assay efficiently discriminate COVID-19 negative and positive samples. The simultaneous detection of IgG, IgM and IgA showed a sensibility of 88.5-96.2% and specificity of 100%. This novel strategy opens a new avenue for flow cytometry-based diagnosis.
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