Efeitos biológicos in vivo e in vitro de polissacarídeos extraídos de liquens sobre macrófagos peritoneais de camundongos

Abstract

Resumo: Neste trabalho, a Alfa-( 1 ->3),( 1 ->4)-D-glucana solúvel em água foi obtida por extração alcalina de talos do líquen Ramalina celastri foi inoculada na cavidade peritoneal de camundongos para verificar seu efeito in vivo sobre a estimulação de macrófagos. Foram avaliadas a produção de peróxido de hidrogênio, a atividade fagocítica, a atividade elicitora de células para a cavidade peritoneal e a produção de óxido nítrico. Os efeitos foram determinados após 7, 15 e 30 dias da inoculação do polissacarídeo intraperitonealmente em camundongos. O número de células da cavidade peritoneal e a produção de H2O2 aumentaram aproximadamente 130 e 75%, respectivamente, 7 dias após a inoculação, decrescendo gradualmente. A produção de H2O2 foi avaliada utilizando o estímulo in vitro de forbol miristato acetato (PMA). Sem este agente indutor a diferença de produção não foi significante quando comparada com o controle. Ensaios de atividade fagocítica usando partículas de látex fluorescente mostraram que a captação destas aumentou 7 dias após a inoculação do polissacarídeo e em 15 dias ainda estava elevada quando comparada com o controle. Os resultados obtidos para a produção de óxido nítrico foram semelhantes aos já descritos, ou seja, em 7 dias a produção desta espécie reativa de nitrogênio estava aumentada em cerca de 70%, retomando aos valores similares ao controle gradativamente. Estes resultados sugerem que esta Alfa-glucana de Ramalina celastri possa funcionar como um modificador da resposta biológica. Com base nestes resultados foi testado uma alteração no protocolo experimental utilizado para os testes de atividade antitumoral, inoculando o polissacarídeo 3 vezes no animal, em intervalos de 7 dias. Nestas condições, o crescimento do Sarcoma-180 foi inibido em aproximadamente 60%. Este resultado pode sugerir que a Alfa-glucana possa ser um tolerógeno, induzindo uma imunotolerância no animal. A estimulação de macrófagos in vitro também foi avaliada utilizando a Alfa-glucana de R. celastri e uma galactomanana sulfatada extraída de Cladonia ibitipocae (GMS). Ao contrário dos resultados in vivo, a Alfa-glucana inibiu a produção de H2O2 em cerca de 65% numa dose de 1000 µg/ml. Porém, a GMS estimulou a produção deste metabólito em 100%, em uma concentração de 100 µg/ml, apresentando uma diminuição da viabilidade de macrófagos em cerca de 15% numa concentração de 500 µg/ml. Este polímero ainda diminuiu a adesão de células HeLa às moléculas da matriz extracelular laminina e fibronectina.

Abstract: An Alfa- 1 ->3),( 1 ->4)-D-glucan was extracted from the lichen Ramalina celastri with aqueous alkali. It was water soluble and at a dose of 200 mg.kg-1 decreased the Sarcoma-180 tumor size by ~80%, and the presence of plasmolymphocytary infiltration surrounding the tumor suggested macrophage stimulus. The polysaccharide was used to evaluate its effects on peritoneal exudate cells, namely, hydrogen peroxide production, phagocytic activity, NO* production and cell-eliciting activity. The polysaccharide was injected into mice and after 7, 15 and 30 days the cells were collected from the peritonea. The number of peritoneal cells increased by -130% 7 days after inoculation, and then decreased gradually. On in vitro phorbol myristate acetate (PMA) triggering, hydrogen peroxide production increased 75% at 7 and 15 days after inoculation. Without PMA, the difference of production was not significant. Phagocytic assays using fluorescent beads showed that the uptake increased 7 and 15 days after inoculation, when compared to the control. NO* production increased by ~70%, gradually returning to the normal levels. These results suggest a possible role of the Ramalina celastri glucan as a biological response modifier. Another protocol of antitumor activity was tested, injecting the polysaccharide 1,7 and 15 days after tumor implantation, which decreased tumor growth by ~60%. These results indicate that the glucan can be a tolerogen with compared with the original protocol, using a single dose. Studies on in vitro macrophage stimulation were carried out using the Alfa-glucan and a chemically sulfated Cladonia ibitipocae galactomannan (GMS). In contrast with the in vivo results, the glucan inhibited H2O2 production by -65% using a dose of 1000 µg/ml. However, GMS increased it by 100%, at a lower dose of 100 µg/ml. This polymer showed a decrease of viability of macrophages by -15% at a dose of 500 µg/ml in the MTT assay and decreased HeLa cell adhesion on to the extracellular matrix proteins, fibronectin and laminin.