Virulence potential of the Fonseceae species related to the chromoblastomycosis diseases
Resumo
Resumo: As leveduras negras associadas à infecção em hospedeiros animais pertencentes à família Herpotrichiellaceae são microorganismos extremamente relevantes quanto a sua natureza ecológica e consequentemente, em relação às interações desenvolvidas com diferentes substratos e hospedeiros. As infecções recorrentes e consistentes causadas por estes agentes indicam uma possibilidade de adaptação ao hospedeiro. Neste contexto, a doença cromoblastomicose caracterizada por uma infecção subcutânea em humanos, causada por diferentes espécies desta família, é decorrente da implantação destes agentes de forma traumática, com posterior adaptação no tecido subcutâneo do hospedeiro através da formação de estruturas diferenciadas, denominadas de corpos muriformes. A hipótese atual baseada em dados epidemiológicos é que os pacientes adquirem a doença principalmente a partir de um trauma causado por material de origem vegetal, como por exemplo, espinhos de plantas. Portanto, o objetivo principal deste estudo foi estabelecer protocolos de isolamento e avaliação do potencial de virulência das espécies do gênero Fonsecaea relacionadas à doença cromoblastomicose. Para os testes de virulência foram utilizadas linhagens de procedência clínica, agentes de cromoblastomicose, Fonsecaea pedrosoi (CBS 271.37) e Fonsecaea monophora (CBS 102248); e a de origem ambiental Fonsecaea erecta (CBS 125763) isolada de planta viva, em região endêmica da doença. Para o estudo foram estabelecidos protocolos de infecção utilizando como modelo vegetal, plantas, produtoras de espinhos: a planta rastejante Mimosa pudica e a palmeira Bactris gasipaes. E, em animais foi adotado como modelo a larva de Tenebrio molitor para estudos de virulência e de isolamento ambiental. Testes complementares de imunogenicidade foram realizados utilizando camundongos BALB/c. As plantas eram produzidas in vitro com posterior transferência para vasos. Plantas in vitro e em vasos eram inoculadas por injeção direta da solução fúngica na concentração 102cels/mL no caule e através da contaminação do meio de cultura e ou do solo. Todas as linhagens foram capazes de colonizar os tecidos das duas espécies de plantas produzidas in vitro e em vaso. As linhagens clínicas F. monophora e F. pedrosoi permaneciam na região da epiderme das plantas inoculadas, enquanto que, a espécie associada à planta viva F. erecta apresentava um perfil colonizador na planta, semelhante aos isolados endofíticos utilizados como controles neste trabalho. As análises histológicas mostraram que as linhagens clínicas eram capazes de invadir os tecidos das plantas, permanecendo como células leveduriformes e poucas hifas na epiderme, enquanto que a F. erecta isolada de planta viva, assim como os endofíticos utilizados como controle, produziam hifas dentro dos tecidos das plantas atingindo a região de vascularização. Nos testes de virulência utilizando T. molitor observou-se que as larvas infectadas com F. erecta apresentaram menor taxa de sobrevida, seguidas das infectadas por F. monophora e F. pedrosoi, demonstrando que a espécie procedente de planta viva pode sobreviver dentro do hospedeiro animal. Entretanto, somente a espécie de origem clínica F. pedrosoi foi capaz de formar células muriformes, considerada característica clinica da cromoblastomicose. Tais resultados, demonstraram diferenças na ecologia e virulência destas linhagens, além do potencial dessas larvas como modelo de reprodução da doença. O re-isolamento dos fungos a partir das larvas infectadas após 240 horas demonstrou que F. erecta apresentava diminuição significativa, baseado nas UFC/mL, em relação às linhagens clínicas, o que pode ter sido induzida pela alta imunogenicidade desta espécie verificada nos ensaios imunológicos em camundongos BALB/c. O T. Molitor foi também avaliado como meio de enriquecimento e isolamento onde foram obtidos a partir de larvas inoculadas com amostras de coco da palmeira babassu quatro isolados da família Herpotrichiellaceae, identificados como F. erecta (n=2) e F. monophora (n=2) e seis isolados da ordem Capnodiales identificados como Cladosporium cladospoioides (Cladosporiacea) e Pseudocercospora norchiensis (Mycosphaerellaceae). Estes resultados indicaram a eficácia deste modelo como um método alternativo de isolamento de leveduras negras do meio ambiente. Em conclusão, estes estudos demonstraram que as linhagens de origem clínica podem sobreviver em tecidos vegetais, confirmando a hipótese de infecção traumática destes agentes a partir de substratos vegetais, revelando, no entanto, um comportamento diferenciado das espécies de procedência clinica e daquelas isoladas de plantas vivas. Além disso, os testes realizados em T. Molitor mostraram um modelo potencialmente útil para elucidar e comparar a virulência e o dimorfismo desses agentes, e assim, proposto como o primeiro modelo animal para a reprodução de células muriformes. Palavras-chave: Leveduras negras, Testes de virulência, Isolamento, F. pedrosoi, F. monophora, F. erecta, cromoblastomicose. Abstract: The black yeasts belonging to Herpotrichiellaceae family cause infections in animal hosts and are extremely relevant microorganisms with regard to their ecology and interactions with different substrates and hosts. Recurrent and consistent infections caused by these agents indicate a possible adaptation potential in the host. In this context, chromoblastomycosis is characterized by a subcutaneous infection due to traumatic implantation of these agents within the host tissue, followed by their adaptation through the formation of differentiated structures called muriform cells. According to the current hypothesis that is based on existing epidemiological data, patients acquire this disease mainly from the trauma caused by plant materials (e.g., thorns). Therefore, the aims of this study were to establish protocols for their isolation and to evaluate virulence potential of the Fonsecaea species that associate with animals and plants and leads to chromoblastomycosis. For the virulence tests, the clinical strains of chromoblastomycosis agents namely, Fonsecaea pedrosoi (CBS 271.37) and Fonsecaea monophora (CBS 102248) and an environmental species isolated from living plants in the endemic area known as Fonsecaea erecta (CBS 125763) were used. The infection protocols, in plants, were established using the thorny plants, Mimosa pudica (creeper) and Bactris gasipaes (palm tree), as models. In animals, the Tenebrio molitor larvae were chosen for the evaluation of virulence and environmental isolation and BALB/c mice were used for performing complementary immunogenicity tests. The plants were produced in vitro with subsequent transfer to culture vessels. These in vitro and in vessel plants were then inoculated by direct injection of the fungal solution (102 cells/mL) into the stem and by contamination of the culture medium and/or soil. All strains were able to colonize tissues of both the in vitro and in vessel produced plant species. The histological analysis showed that the clinical strains of F. monophora and F. pedrosoi remained in the epidermal region of the infected plants as yeast cells and hyphae, while the clinical strain of F. erecta (associated with the living plant) produced hyphae within the tissues of the plants, reaching the region of vascularization. The colonization profile of F. erecta was similar to that of the endophytic isolates, used as controls in this work. In the virulence tests, it was observed that the T. molitor larvae that were infected by F. erecta had the lowest survival rate followed by the larvae infected with F. monophora and F. pedrosoi, indicating that the fungal species from a living plant have better survivability inside a host animal. However, it was also observed that only the clinical strain of F. pedrosoi was able to form muriform cells, constituting a hallmark of chromoblastomycosis. These results demonstrated that there were differences in ecology and virulence among these strains and also hinted at the potential of these larvae to be used as disease models. The re-isolation of fungi from the infected larvae after 240 h showed a significant decrease in the quantity (in CFU/mL) of F. erecta, in relation to other clinical strains. This seemed to be induced due to the high immunogenicity of this species that was seen in immunological assays of BALB/c mice. The T. molitor was also employed in methods for enrichment and isolation of chromoblastomycosis causing agents from the environment. A total of four isolates of the family Herpotrichiellaceae, namely, F. erecta (n=2) and F. monophora (n=2) and six isolates of the order Capnodiales, namely, Cladosporium cladospoioides (Cladosporiacea) and Pseudocercospora norchiensis (Mycosphaerellaceae), were obtained from the larvae inoculated with coconut samples from the babassu palm tree. These results revealed the efficacy of this model as an alternative method for the isolation of black yeast from the environment. In conclusion, this study showed the ability of clinical strains to survive in plant tissues, confirming the hypothesis that these traumatic infection-causing agents are derived from plant substrates. The different behavior of these species originating from the clinical and environmental (living plants) source was also recorded. In addition, the T. molitor larvae functioned as a potentially useful model for elucidation of virulence and dimorphism of these agents and thus proposed as the first animal model for the reproduction of muriform cells in research. Keys-words: Black yeasts, virulence tests, isolation, F. pedrosoi, F. monophora, F. erecta, chromoblastomycosis.
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