Aplicação da técnica de RNA de interferência no silenciamento dos genes glc-5, DIM-1, GAPDH, GDH e B-tubulina de Haemonchus contortus

Abstract

Resumo: Dos parasitos que infectam ovinos, o que mais se destaca é o Haemonchus contortus, devido ao fato de ser um parasito hematófago. O controle deste é feito com o uso constante de produtos de largo-espectro o que gera a seleção de populações resistentes, tornando inviável a utilização de diversas drogas comerciais. Assim, é necessário desenvolver métodos inovadores de controle para esta parasitose, como por exemplo, o uso da técnica de RNA de interferência (RNAi). Essa técnica utiliza pequenas moléculas de RNA para interferir com a expressão de um gene, causando seu silenciamento. Este trabalho teve o objetivo de desenvolver uma estratégia biotecnológica com o uso de RNAi para alvejar diversos genes de H. contortus. Parasitos adultos foram obtidos de ovinos da fazenda da UFPR na região de Curitiba, Paraná, Brasil. Amostras de RNA foram obtidas destes parasitos e utilizadas para a produção de DNA complementar, utilizando primers específicos contendo promotores T7, que por sua vez foram clonados e transformados em cepas de Escherichia coli TOP10 e BL21 (DE3). A identidade dos produtos clonados foi checada por sequenciamento e transferidos para estirpe de E. coli carregando o gene de T7 RNA polimerase. Culturas de bactérias carregando os segmentos codificadores flanqueados por promotores T7 foram testadas em larvas de terceiro estágio (L3) de H. contortus em teste in vitro, para avaliar a eficiência do silenciamento na redução de motilidade das L3. O teste de migração de L3 mostrou diferença significativa (p=0,05) entre os grupos tratados e controle, além de diferença significativa (p=0,05) entre o mesmo grupo nas avaliações depois de 24 e 48 horas em população de 74% de H. contortus. A técnica de RNAi se mostrou promissora no silenciamento in vitro, com resultados que incentivam o avanço para testes in vivo para comprovação da eficácia da técnica como alternativa para o tratamento antiparasitário

Abstract: The parasite that most significantly affects sheep is Haemonchus contortus, due to the fact that it is a hematophagous parasite. The control of this parasite is achieved through the constant use of broad-spectrum antiparasitic drugs, which generate the selection of resistant populations, making the use of several commercial drugs ineffective and thus unfeasible. As a result, it is necessary to develop innovative control methods for this parasitosis, for example, the interfering RNA (RNAi) technique. This technique uses small RNA molecules to interfere with the expression of a gene, causing its silencing. This work aimed to develop a biotechnological strategy using RNAi to target several H. contortus genes. Adult parasites were collected from sheep at the UFPR farm in Curitiba, Paraná, Brazil. RNA samples were obtained from these parasites and used for the production of cDNA using specific primers containing T7 promoters for further cloning and transformation into Escherichia coli TOP10 and BL21 (DE3) strains. The identity of the cloned products was checked by sequencing and transferred to E. coli strain carrying the T7 RNA polymerase gene. Bacterial cultures carrying the coding segments flanked by T7 promoters were tested in third instars larvae (L3) of H. contortus in in vitro test, to evaluate the efficiency of the silencing through the reduction of L3 motility. The test of L3 migration showed a significant difference (p=0,05) between the treated and control groups. In addition, a notable difference (p=0,05) was observed in the evaluations of the same group, between a 24 and 48 h exposition, in a population of 74% of H. contortus. The RNAi technique proved to be promising in in vitro silencing, with results that encourage the advancement of in vivo testing to prove the efficacy of the technique as an antiparasitic treatment alternative