Identificação molecular da fonte de alimentação sanguínea da fauna de Culicidae (Diptera) nas áreas urbanas e silvestres do município de Paranaguá (PR)

Abstract

Resumo: A preferência alimentar é uma característica inata dos mosquitos (Culicidae) que é modulada por fatores que determinam os padrões de busca, seleção do vertebrado e frequência das interações, podendo envolver a transmissão de agentes patogênicos, representando riscos para a saúde pública. A Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) permite a identificação desses vertebrados através do sangue ingurgitado contido no intestino dos culicídeos, mas compreende algumas dificuldades que limitam o sucesso da amplificação como o grau de digestão do sangue e a necessidade da preservação da integridade do DNA. O presente estudo teve como objetivos identificar e caracterizar o hábito alimentar de culicídeos em área urbana e florestal do município de Paranaguá, Paraná. A amplificação segundo a temperatura e período de armazenamento foi verificada em Aedes aegypti da colônia Rockefeller, alimentados com sangue de camundongos e armazenados a -20°C ou -80°C por 30 a 180 dias em cada temperatura testada. Para a caracterização alimentar e determinação do sucesso de amplificação segundo o grau de digestão baseado na escala de Sella, foram coletados, por aspiração entre outubro de 2016 e março de 2017, 1.951 fêmeas de mosquitos de Paranaguá (Parque Estadual do Palmito e Ilha dos Valadares) das quais 155 apresentavam o abdômen com sangue. Todas as fêmeas visivelmente ingurgitadas foram submetidas à extração do DNA e à amplificação por PCR com primers específicos para vertebrados baseados no gene COI, sequenciando-se os fragmentos amplificados e identificando os vertebrados por comparação com sequências presentes em bancos de dados. No tempo máximo de armazenamento, a temperatura de -20 °C foi suficiente para a preservação do DNA, apresentando sucesso equivalente ao armazenamento a -80 °C. Fêmeas ingurgitadas seguramente classificadas entre os índices 2 a 6 da escala de Sella resultaram em amplificações bem-sucedidas concentradas entre os coeficientes 2 e 3, tendo o sucesso de amplificação significativamente reduzido a partir do índice 4 (24h após a ingestão), diminuindo progressivamente com o avanço da digestão. Sete espécies de culicídeos (Anopheles cruzii, Aedes fluviatilis, Aedes scapularis, Psorophora ferox, Culex quinquefasciatus, Culex mollis e Culex intrincatus), quatro subgêneros [Ae. (Ochlerotatus), Cx. (Culex), Cx. (Melanoconion) e Cx. (Microculex)] e um gênero (Limatus) tiveram suas fontes de repasto identificadas, diversificando seu comportamento alimentar através da utilização de 17 espécies de vertebrados, sendo uma de anfíbio, três de mamíferos e 13 de aves, mais dois gêneros de vertebrados (anfíbio e ave). O hábito alimentar ornitofílico compreendeu espécies de aves domésticas e silvestres e os mamíferos identificados foram cachorros, cavalos e humanos. Embora a ornitofilia tenha se destacado tanto na área urbana como na florestal, a maioria das espécies de culicídeos selecionaram os vertebrados possivelmente de acordo com a sua disponibilidade, incluindo diferentes grupos. Na área florestal, esta disponibilidade e diversidade foram aparentemente maiores quanto mais próximo à borda da mata, influenciando a quantidade de fêmeas ingurgitadas coletadas. Palavras-chave: Hematofagia, mosquito, vertebrados, grau de digestão, armazenamento

Abstract: Mosquitoes food preference is an innate characteristic modulated by factors as patterns of search, vertebrate selection and frequency of interactions, and may involve the transmission of pathogens, representing risks to public health. The Polymerase Chain Reaction (PCR) allows identification of vertebrates through the engorged blood contained in the gut of Culicidae insects, but shows some difficulties regarding the limitation of the amplification success as the degree of digestion of the blood and the necessity DNA integrity preservation. The present study aimed to identify and characterize the food habit of Culicidae from the urban and forest area of Paranaguá city, Paraná. The amplification according to temperature and storage period treatments was verified in 36 Aedes aegypti mosquitoes from Rockefeller colony, fed with blood from mice and stored at -20 °C or -80 °C for 30 up to 180 days at each temperature tested. Food characterization and determination of the amplification success according to the degree of digestion based on the scale of Sella, were evaluated collecting mosquitoes by aspiration during October 2016 to March 2017. A total of 1.951 female mosquitoes were collected from Parque Estadual do Palmito (forest area) and Ilha de Valadares (urban area) of which 155 were with abdomen filled with blood. All visibly engorged females were carried out to DNA extraction and PCR amplification with specific primers for vertebrates based on COI gene, then sequencing of amplified fragments, identifying vertebrates by comparison with sequences present in databases. At the maximum storage time, the temperature of -20 °C was sufficient for DNA preservation, presenting success equivalent to the storage at -80°C. Engorged females surely classified in scores of 2 up to 6 on the Sella scale resulted in successful amplification concentrated between scores 2 and 3, with amplification success significantly reduced from score 4 (24h after ingestion), decreasing progressively with the advancement of digestion. Seven species of Culicidae (Anopheles cruzii, Aedes fluviatilis, Aedes scapularis, Psorophora ferox, Culex quinquefasciatus, Culex mollis and Culex intrincatus), four subgenres [Ae. (Ochlerotatus), Cx. (Culex), Cx. (Melanoconion) and Cx. (Microculex)] and a genus (Limatus) had their vertebrates identified, diversifying their feeding behavior through the use of 17 vertebrate species, one of amphibian, three of mammals and 13 of birds, also two genera of vertebrates (amphibian and bird). The ornithophilic food habit comprised species of domestic and wild birds and identified mammals were dogs, horses and humans. Although ornitophilic habit has stood out in both urban and forest areas, most Culicidae species possibly selected vertebrates according to availability, including different groups. In the forest area, this availability and diversity were apparently higher as closer to the edge of the forest, influencing the amount of engorged females collected. Key words: Hematophagy, mosquito, vertebrates, degree of digestion, storage