Purificação e caracterização de uma celulase de Azospirillum brasilense

Abstract

Resumo : A biomassa lignocelulósica constitui um dos materiais biológicos mais abundantes do planeta, sendo de grande interesse comercial a obtenção de enzimas capazes de degradá-la. As celulases e hemicelulases conseguem cumprir esse papel, podendo ser utilizadas em diversos processos industriais, como a produção de biocombustíveis (principalmente o etanol de 2ª geração), biopolimento e remoção de cor em têxteis, clarificação de sucos e outros métodos da indústria alimentícia. Existem três tipos diferentes de celulases, as endoglucanases, as exoglucanases e as ß-glucosidases, que atuam conjuntamente na quebra das fibras de celulose até glicose. O objetivo deste trabalho é purificar e caracterizar uma ß-glucosidase proveniente da bactéria promotora de crescimento vegetal Azospirillum brasilense. O gene que codifica para essa proteína já foi isolado, sequenciado e clonado no plasmideo de expressão pET28. A purificação da proteína foi feita por cromatografia de afinidade em uma coluna de níquel de 1ml, a determinação da atividade da enzima foi feita utilizando o substrato p-nitrofenil-ß-D-glicopiranosídeo (1 mM) que quando clivado por ß-glucosidases libera um composto (paranitrofenol) com coloração amarela que pode ser quantificado por colorimetria. A enzima apresentou boa atividade entre os pHs 7 e 9, sendo mais ativa no pH 8, não precisou de um cofator para catalisar a reação, os íons Ca²+ , Mg2+ e Cu2+ não causaram alterações na atividade, assim como o EDTA, portanto acreditamos que ela também não possui um metal na sua estrutura. A enzima perdeu toda atividade quando incubada por 30 minutos a 60ºC e depois testada a 37ºC, ela foi mais ativa quando incubada no gelo e depois testada a 55ºC. A ß-glucosidase parece ser bastante halotolerante, suportando concentrações de até 1M de NaCl sem perder muita atividade, na concentração de 2M apresenta 67% da atividade e na de 6M, 27%. A enzima apresentou uma temperatura de desnaturação de 58,7ºC. Não foi possível determinar por microscopia eletrônica se a enzima está relacionada com a colonização de A. brasilense na planta.