Identificação genética de Ulva (Ulvaceae, Ulvales) na porção norte-nordeste da Baía de Osaka, Japão, e elaboração de uma nova metodologia de identificação molecular usando PCR-RFLP

Abstract

Resumo : As espécies do gênero Ulva Linnaeus, uma das mais amplamente distribuídas e estudadas macroalgas verdes no mundo são difíceis de distinguir por características fenotípicas. Caracteres morfológicos como tamanho, distribuição e formas celulares, protuberâncias marginais das frondes, reprodução e números de pirenóides são usadas para diferenciação inter-específicas de Ulva. Entretanto análises usando marcadores moleculares tornaram-se uma ferramental complemental para delimitar e identificar essas algas verdes. Na Baía de Osaka, o intenso fluxo de navios provenientes de varias regiões do mundo e a orla modificada por ação antrópica torna-se um habitat favorável para espécies invasoras. No presente estudo, as algas do gênero Ulva foram identificadas a partir de análises moleculares da região ITS1 do rDNA como também o desenvolvimento de uma metodologia de identificação específica molecular mais simples, rápida e de menor custo usando Enzimas de Restrição (PCR-RFLP) no ITS1 do DNA ribossômico. As amostras foram coletadas de sete pontos pré-determinados na porção Norte-Noroeste da Baía de Osaka, Japão, entre os meses de fevereiro de 2006 e março de 2007. O protocolo CTAB de extração do DNA algal e o kit DNeasy Plant Mini kit (QIAGEN) de extração de plantas foram comparadas. Os resultados das analises de biologia molecular da região ITS1 do DNA ribossômico mostraram 10 espécies diferentes de Ulva na Baía de Osaka: Ulva arasakii Chihara, U. californica Wille, U. compressa Linnaeus, U. fasciata Delile, U. flexuosa Wilfen, U. linza Linnaeus, U. ohnoi Hiraoka & Shimada, U. pertusa Kjellman, Ulva sp. (scandinavica?) e U. tanneri Hayden & Waaland. Dentre essas elas, as espécies Ulva arasakii, U. californica, U. flexuosa e Ulva sp. (scandinavica?) foram reportadas pela primeira vez na Baía de Osaka. A metodologia utilizando Enzimas de Restrição (PCR-RFLP) mostrou resultados significativos e comparada ao seqüenciamento genético da regia ITS1 do rDNA foi de menor dificuldade e custo além de despender menos tempo, sugerindo como uma nova ferramenta taxonômica para ser utilizada em combinação com as existentes para um monitoramento ambiental de espécies de Ulva.

Abstract: The species of Ulva Linneaus genus, one of the most widely distributed and studied green seaweeds in the world, is difficult to distinguish because of the plasticity of the fenotipics characters. Morphological characters such as cell sizes, arrangement and shapes, marginal tooth-like protuberances, reproduction and number of pyrenoids were common used to differentiate species, however, molecular analysis turned a complementary tool to delimit and identify these green algae. In Osaka bay, the intense stream of cargo ships proceeding for many countries and the modified maritime edge by human action turn to be a ideal habitat for foreign species. In this study, the genus Ulva was identified based on molecular analysis of ITS1 sequences of rDNA. Moreover, the development of quickly and easily species identification method was made using Restriction Enzymes (PCR-RFLP) in ITS rDNA region. Samples were collected from 7 pre-determined sites in north and northwest portion of Osaka Bay, Japan, at period of February 2006 to march 2007 . DNA extraction of plants using CTAB protocol and DNeasy Plant Mini kit (QIAGEN) were also compared. The results of molecular analysis in ITS1 rDNA region of samples collected showed 10 species of Ulva in Osaka Bay: Ulva arasakii Chihara, U. californica Wille, U. compressa Linnaeus, U. fasciata Delile, U. flexuosa Wilfen, U. linza Linnaeus, U. ohnoi Hiraoka & Shimada, U. pertusa Kjellman, Ulva sp. (scandinavica?) and U. tanneri Hayden & Waaland. Among those species, Ulva arasakii, U. californica, U. flexuosa and Ulva sp. (scandinavica?) were firstly reported at the Osaka Bay. Restriction Enzymes (PCR-RFLP) method showed trustworthy results and demonstrated that this method is more quickly, easily and with lower cost comparing with ITS rDNA sequencing method, suggesting to use this methodology in a monitoring program of Ulva. Key words: Green Seaweeds. Ulva. ITS1 rDNA sequences. PCR-RFLP. Genetic identification. Ulvophyceae