Clonagem e expressão heteróloga de uma proteína homóloga a alérgeno presente no veneno de aranha-marrom (Loxosceles intermedia)

Abstract

Resumo: O gênero Loxosceles inclui várias espécies popularmente conhecidas como aranhas-marrons. O envenenamento pode causar, entre outras manifestações clínicas, reações inflamatórias que incluem aumento da permeabilidade vascular, infiltrado leucocitário, rash cutâneo e exantema pustuloso. Relatos de acidentes com animais peçonhentos comumente causam reações alérgicas assim como choques anafiláticos. As moléculas descritas no veneno de Loxosceles intermedia incluem fosfolipases-D, hialuronidases, metaloproteases e toxinas não-enzimáticas. Devido ao pequeno volume produzido e a baixa representatividade dessas toxinas no veneno, técnicas de biologia molecular permitem a identificação e expressão de várias dessas toxinas. A partir de uma biblioteca de cDNA de Loxosceles intermedia foi identificado um transcrito que apresentou identidade com alérgenos presentes em uma espécie de vespa e formiga. A sequência nucleotídica dessa proteína homóloga a alérgeno possui 415aa. Por meio de predição da sequência aminoacídica foram encontrados possíveis sítios de Nglicosilação. Segundo o banco de dados ProtParam esta molécula pertence a uma família de proteínas ricas em cisteínas. O objetivo deste trabalho foi a clonagem, expressão heteróloga e avaliação da sua atividade biológica de uma possível toxina alergênica presente no veneno de Loxosceles intermedia, com o intuito de compreender o papel desta no loxoscelismo. De acordo com a nomenclatura da área (WHO/IUIS): a toxina recombinante foi denominada Lox i 1. Foram utilizados modelos heterólogos de expressão procariótico Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS e modelo eucariótico Pichia pastoris X-33. A ligação da sequência nucleotídica do alérgeno Lox i 1 foi obtida em vetor de expressão pET-20b e pPICZ_C, assim como, a transformação destas construções em E. coli e P. pastoris, respectivamente. Por meio de testes de indução nas concentrações de 0,1 a 1,0mM de indutor a 37 _ C não houve expressão da proteína recombinante. Entretanto, foi possível obter a toxina recombinante em cultura de leveduras Pichia pastoris, cuja a padronização foi feita em 1% de metanol a 30º C por 5 dias. A purificação foi feita por cromatografia de afinidade utilizando resina Ni-NTA em pH 9,0. Análises espectroscópicas em Dicroísmo Circular foram realizadas para a formação de estruturas secundárias da proteína recombinante, o que indicou o dobramento e solubilidade da toxina recombinante em meio aquoso. Os dados da deconvolução indicaram 16% de ±-hélice e 19% de ±-folha. Os dados obtidos permitiram investir na prospecção da atividade biológica de Lox i 1 por meio de um ensaio de Permeabilidade Vascular em camundongos. O qual foi capaz de aumentar a permeabilidade vascular em camundongos. Portanto, foi pela primeira vez na literatura relatada a expressão e a avaliação da atividade biológica de uma proteína homóloga a alérgeno presente no veneno de L. intermedia. Soma-se a isso o fato de que é crescente a utilização de alérgenos recombinantes em imunoterapia e testes diagnósticos para hipersensibilidade. Futuramente estudos estruturais e imunológicos de Lox i 1 irão contribuir para um maior conhecimento das bases moleculares de alergenicidade no loxoscelismo. Palavras-chave: Reações alérgicas, Loxoscelismo, Alérgeno, Rash cutâneo.

Abstract: The Loxosceles genus includes several species known as brown spiders. The envenomation can trigger among other clinical manifestations, inflammatory conditions including increased vascular permeability, cutaneous rash, edema and exanthema pustulosis. Reports of accidents involving venomous animals commonly cause allergic reactions like rash, exanthem pustulosis and anaphylactic shock. The molecules described in the Loxosceles intermedia venom include phospholipase-D, hyaluronidase, metalloproteases and non-enzymatic toxins. Due to the small volume produced and the low representation of these toxins in the venom, molecular biology techniques allow the identification and expression of several of these toxins. By a cDNA library of Loxosceles intermedia a sequence show identity with allergens present in a species of wasp and ant was identified. The nucleotide sequence of this protein homologous to allergen has 415 aminoacids. A putative N-glycosylation site was observed in this sequence. According to the ProtParam database this molecule belongs to a family of cysteine-rich proteins. The objective of this work was the cloning, heterologous expression and evaluation of the biological activity of a putative allergen toxin present in the venom of Loxosceles intermedia, in order to further the knowledge of the loxoscelism. According to the nomenclature of the allergens (WHO / IUIS) the recombinant toxin L. intermedia venom was named Lox i 1. The subcloning of Lox 1 was obtained in vector pET-20b and pPICZ_C to use heterologous expression with a prokaryotic model, E. coli BL21(DE3)pLysS, and eukaryotic model Pichia pastoris X-33. The test of the recombinant protein expression was performed from 0.1 to 1.0 mM IPTG concentrations at 37 _ C. However, it was only possible to obtain the recombinant toxin in cultured yeast Pichia pastoris, whose standardization parameters was 1 % methanol at 30°C for 5 days. Purification was performed by affinity chromatography using Ni-NTA resin with pH 9.0. Analysis by Dichroism Circular were performed for analyses of Lox i 1 secondary structures and solubility The data indicated the deconvolution of 16 % ± - helix of ± 19% sheet. The biological activity of Lox i 1 was tested by vascular permeability assay in mice. The Lox i 1 was able to increase vascular permeability in this model. For the first time is report in the literature the heterologous expression and evaluation of biological activity of a protein homologous to allergens present in the venom of L. intermedia. In addition, future structural and immunological studies of Lox i 1 will contribute to a better understanding of the molecular basis of allergenicity in loxoscelism. Key words: Allergic reactions, Loxoscelism, Allergen, Cutaneous rash.