Vírus da dengue : novas abordagens para o estudo da neuropatogênese

Abstract

Resumo: A dengue constitui um grande problema de saúde pública nas regiões tropicais e subtropicais do globo. Apesar dos grandes avanços na biologia do vírus da dengue (DENV), muitos aspectos da patogênese permanecem desconhecidos. A ausência de um modelo animal adequado, que mimetize o espectro da infecção pelo DENV, institui uma das principais dificuldades no estudo da dengue. Múltiplas linhas de evidências indicam que a gravidade da doença é, provavelmente, determinada pela interação entre fatores virais e do hospedeiro. Alguns determinantes genéticos de virulência intrínseca do DENV no hospedeiro foram identificados, no entanto, nenhuma correlação conclusiva entre genótipo viral, transmissibilidade do vírus e patogenicidade foi estabelecida. Neste estudo, foi utilizado um painel de DENV tipo 1 (DENV-1) recombinante para investigar o papel de determinantes genéticos de virulência previamente identificados em duas cepas altamente neurovirulentos (FGA/NA D1D e FGA/NA P6). A replicação e capacidade de produção de partículas virais infecciosas foram avaliadas in vivo (modelo de camundongos imunocompetentes), in vitro (linhagens celulares humanas e de insetos) e ex vivo (células dendríticas derivadas de monócitos humanos, mdDCs). Os resultados demonstraram que a associação das mutações na proteína de envelope (E) e no domínio helicase da proteína NS3 (NS3hel) apresentam um efeito sinérgico na modulação do fitness viral in vitro e in vivo, aumentando a síntese de RNA, a carga viral, a robustez da resposta imune e mortalidade dos animais. No entanto, os vírus contendo apenas as mutações na proteína NS3 (NS3435 e NS3480) foram capazes de se replicar eficientemente no SNC de camundongos, de causar encefalite e altas taxas de mortalidade, o que sugere que essas mutações desempenham um papel importante na modulação da replicação viral in vivo. As mutações NS3435 e NS3480 aumentam também o fitness viral em mdDCs, aumentando a síntese de RNA e a carga viral. Além disso, foi demonstrado que as mutações no domínio helicase não afetam significativamente a atividades de protease e NTPase da NS3 in vitro. Apesar do elevado nível de replicação do RNA viral, a infecção pelo DENV foi capaz de reduzir a produção de IFN tipo I em mdDCs após estímulo dos receptores do tipo Toll (TLR). Os resultados apresentados neste trabalho mostram que a presença de uma única mutação no genoma do DENV aumenta o fitness viral in vivo, in vitro e ex vivo e é suficiente para modular a resposta imunológica do hospedeiro e promover uma infecção produtiva. Dadas as limitações atuais para a compreensão das bases moleculares da patogênese da dengue, estes resultados podem contribuir para fornecer subsídios sobre as interações vírus/hospedeiro e novas informações sobre os mecanismos da biologia básica da dengue.

Abstract: Dengue constitutes a significant public health problem in tropical and subtropical regions of the world. Despite major advances in dengue virus (DENV) biology, many aspects of dengue pathogenesis remain largely unknown. The absence of a suitable animal model, mimicking the full spectrum of DENV infections, is one of the main difficulties in studying dengue disease. Multiple lines of evidence indicate that disease severity is probably determined by the interplay of viral and host factors. Some viral genetic determinants of the intrinsic virulence of DENV in the host have been identified; nevertheless, no conclusive evidence of a correlation between viral genotype and virus transmissibility and pathogenicity has been obtained. In this study, we used a panel of recombinant DENV type 1 (DENV-1) to investigate the role of genetic determinants of virulence previously identified in two highly neurovirulent strains (FGA/NA d1d e FGA/NA P6). The replication and viral production capacity of the recombinant viruses were assessed in vivo (immunocompetent mice model), in vitro (human and insect cells lines) and ex vivo (dendritic cells derived from human monocytes, mdDCs). Our results demonstrated that paired mutations in the envelope protein (E) and in the helicase domain of the NS3 (NS3hel) protein have a synergistic effect enhancing viral fitness both in vitro and in vivo by increasing RNA synthesis and viral load, the strength of the immune response and animal mortality. However, the virus carrying mutations only at the NS3 protein (NS3435 and NS3480) was able to replicate efficiently in the CNS of mice and to cause encephalitis and high mortality rates, suggesting that these mutations play an important role on the viral fitness modulation in vivo. These mutations also enhanced viral fitness in mdDCs by increasing RNA synthesis and viral load. Additionally, it has been demonstrated that the mutations NS3435 and NS3480 in the helicase domain do not significantly affect the protease and NTPase activities of NS3 in vitro. Despite the high level of RNA replication, DENV reduces the ability of mdDCs to produce type I IFN triggered by Toll-like receptor (TLR) signaling. The results presented herein show that a single mutation in DENV genome enhances viral fitness in vivo, in vitro and ex vivo and is enough to subvert the host immune response and establish a productive infection. Given current limitations to our understanding of the molecular basis of dengue pathogenesis, these results could contribute to provide insights into virus/host interactions and new information about the mechanisms of basic dengue biology.