Desenvolvimento e aplicação de reatores de enzimas imobilizadas

Abstract

Resumo: Enzimas são catalisadores de reações orgânicas capazes de converter um substrato num produto com elevada seletividade e especificidade. Reatores de enzimas imobilizadas consistem de uma enzima imobilizada em um suporte adequado, tornando-se um catalisador confinado em uma matriz, capaz de ser usado repetidamente pelo tempo que permanecer ativo. Acoplados a cromatografia líquida, os reatores enzimáticos podem ser usados para uma gama de aplicações, como na triagem de inibidores enzimáticos, na biocatálise on-line ou na detecção e purificação de analitos e metabólitos. O presente trabalho teve por objetivo desenvolver reatores de tirosinase e de di-hidrofolato redutase imobilizadas para aplicação na triagem de inibidores enzimáticos e na purificação de moléculas, respectivamente. Agaricus bisporus foi usado como fonte de tirosinase, e as condições para extração da enzima foram otimizadas por planejamento fatorial de experimentos. A enzima foi então imobilizada por ambas as técnicas in situ e in batch em epoxisílica sintetizada por refluxo ou por micro-ondas, e os reatores desenvolvidos foram comparados com relação a quantidade de enzima e de atividade retida durante a imobilização, e quanto a atividade enzimática, cinética e estabilidade da enzima imobilizada. O reator desenvolvido pela técnica in situ em epoxisílica sintetizada por micro-ondas apresentou os melhores resultados, e a sensibilidade do mesmo aos solventes metanol, acetonitrila e dimetilsulfóxido foi primeiramente testada. O reator foi então validado na presença de um inibidor padrão, o ácido kójico, e o mecanismo de inibição competitivo desta substância contra a enzima imobilizada foi determinado. Finalmente, substâncias de diversas classes químicas, inclusive derivados inéditos obtidos por biotransformação e síntese química, foram testadas quanto aos seus potenciais de inibição. O reator de tirosinase foi eficiente na caracterização de inibidores da tirosinase com potencial para serem usados no tratamento de patologias associadas a hiperpigmentação. Para o desenvolvimento de reator de di-hidrofolato redutase imobilizada, a forma monomérica da enzima e duas formas diméricas foram expressadas e purificadas de culturas de Escherichia coli. As enzimas foram então imobilizadas pela técnica in situ em epoxisílica sintetizada por micro-ondas, e os reatores obtidos foram comparados com relação a quantidade de enzima e de atividade retida durante a imobilização, e quanto a atividade e estabilidade da enzima imobilizada. O dímero com resíduo de cisteína terminal apresentou os melhores resultados de imobilização, sendo o reator desta forma enzimática usado para estudo do potencial de aplicação na purificação de moléculas marcadas. Para tanto, metotrexato e ligante de bis-metotrexato foram avaliados quanto a capacidade de se ligarem fortemente e depois se desligarem de maneira controlada em condições brandas da coluna enzimática, podendo funcionar como marcadores de macromoléculas a serem purificadas. Desta forma, provou-se o potencial do reator de di-hidrofolato redutase de ser aplicado de forma eficiente para a retenção e purificação de macromoléculas de interesse marcadas com metotrexato ou ligante de bis-metotrexato.

Abstract: Enzymes are catalysts of organic reactions able to convert a substrate into a product with high selectivity and specificity. Immobilized enzyme reactors consist of an enzyme immobilized in a suitable support, becoming a catalyst confined in a matrix able to be used repeatedly as long as it remains active. Coupled with liquid chromatography, those reactors can be used for a wide range of applications such as in the screening of enzyme inhibitors, in the on-line biosynthesis or in the detection and purification of analites and metabolites. This work aimed to develop tyrosinase and dihydrofolate reductase immobilized reactors to be applied in the screening of enzyme inhibitors and in the purification of molecules, respectively. Agaricus bisporus was used as a source of tyrosinase, and the conditions for enzyme extraction were optimized by factorial design of experiments. The enzyme was then immobilized by both in situ and in batch techniques in epoxysilica synthesized by reflux or by microwave, and the developed reactors were compared in terms of enzyme and activity retained during the immobilization process, and regarding the activity, kinetics and stability of the immobilized enzyme. The reactor developed by the in situ technique in epoxysilica synthesized by microwave presented the best outcomes, and the sensitivity of this reactor to methanol, acetonitrile and dimethyl sulfoxide was first tested. The reactor was then validated in the presence of a standard inhibitor, kojic acid, and the competitive inhibition mechanism of this substance against the immobilized enzyme was determined. Finally, several substances from different chemical classes, including novel derivatives obtained by biotransformation and chemical synthesis, were tested for their inhibitory potential. The tyrosinase reactor was an efficient method to the characterization of enzyme inhibitors with potential to be used in the treatment of pathologies associated with hyperpigmentation. To develop immobilized dihydrofolate reductase reactors, the monomeric form of the enzyme and two dimeric forms were expressed and purified from Escherichia coli cultures. The enzymes were then immobilized by the in situ technique in epoxysilica synthesized by microwave, and the reactors were compared in terms of enzyme and activity retained during the immobilization, and about the activity and stability of the immobilized enzyme. The dimeric enzyme containing a terminal cysteine presented the best immobilization outcomes and its reactor was thereby used to study the potential application of the technique in the purification of labeled macromolecules. For this purpose, methotrexate and bis-methotrexate trilinker were assessed for their ability to strongly bind and then release in a controlled manner under mild conditions from the enzymatic reactor, being able to act as markers of macromolecules to be purified. Therefore, it was proved the potential of immobilized dihydrofolate reductase reactors to be applied efficiently to the retention and purification of interest macromolecules labeled with methotrexate or bis- methotrexate trilinker.