Produção de reagentes para o diagnóstico da infecção pelo vírus da Leucose bovina

Abstract

Resumo: O interesse pelo estudo da leucose enzoótica bovina (LEB) tem sido cada vez maior, não somente como modelo para o entendimento de enfermidades humanas e animais recém reconhecidas, como também pelo temor do potencial zoonótico atribuído ao vírus da leucose bovina (VLB) e a outros retrovírus animais. No Brasil, essa virose foi introduzida na década de 70 pela importação de animais infectados. Como nenhum programa de controle foi implantado, a doença disseminou-se e vem sendo relatada em vários estados do país. A ausência de reagentes padronizados no mercado interno evidencia-se como um ponto de estrangulamento na efetivação do diagnóstico e, conseqüentemente, tem sido o principal obstáculo para se estabelecer um programa de controle da LEB. Neste estudo objetivou-se o desenvolvimento e a padronização de reagentes biológicos, visando sua produção industrial. Esses insumos foram utilizados em provas imunológicas, AGID e ELISA, a fim de se detectar a presença de anticorpos direcionados ao VLB. Os resultados obtidos na execução dessas técnicas foram validados pela reação em cadeia pela polimerase em tempo real (PCR-TR), que foi considerada o teste padrão ouro nesse experimento, identificando no sangue dos animais infectados, o DNA proviral do VLB. Para a correlação dos resultados com a forma clínica da enfermidade, certos parâmetros hematológicos foram avaliados por meio do hemograma e de alguns exames bioquímicos. Cinqüenta amostras de sangue de animais provenientes de um rebanho bovino leiteiro naturalmente infectado foram examinadas pelos testes de AGID, ELISA e PCR-TR. Obteve-se uma concordância de resultados nos três métodos de diagnóstico em 62 % das amostras, sendo 27 positivas e 4 negativas. Ao se observar os resultados divergentes, pôde-se notar que os testes imunológicos falharam na identificação de oito animais infectados, considerando que os mesmos apresentaram reatividade na PCR-TR. Em contrapartida, em quatro animais que apresentaram anticorpos detectáveis pelas técnicas de AGID e ELISA, não foi possível a amplificação de parte do DNA proviral pela PCR-TR nos linfócitos circulantes. O teste ELISA apresentou maior sensibilidade que a prova de AGID, no entanto, gerou um resultado falso negativo e outro falso positivo em relação às demais técnicas. Três da cinqüenta amostras apresentaram linfocitose, alteração relacionada à LEB. Este estudo demonstra que as provas imunológicas de AGID e ELISA, desenvolvidas com os reagentes produzidos neste trabalho, poderiam ser utilizadas como testes de triagem em um programa de controle da LEB, salientando-se que os resultados negativos em animais provenientes de rebanhos infectados deveriam ser confirmados ou não pela PCRTR.

Abstract: The ever-greater interest in EBL is prompted by its usefulness as a model system to understand newly recognized human and animal diseases, as well as by the fear of the zoonotic potential attributed to BLV and other animal retroviruses. The EBL was introduced in Brazil through infected animals imported in the 70's. No control program has been implemented since then; thus, the disease was disseminated and has been reported in many states of the country. The absence of standarized reagents in the local market has been the major obstacle to establish a control program for EBL. The purpose of this study was the development and standardization of biological reagents to aim at their industrial production. These ones were used in immunological tests, AGID and ELISA, in order to detect VLB antibodies. Also, a real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) assay was developed for BLV proviral DNA detection in blood of infected animals and used as the gold standard test to validate AGID and ELISA results. Some hematological parameters were evaluated by hemogram and biochemical examinations in order to correlate the results and the disease clinical expression. Fifty blood samples of animals from a naturally infected bovine dairy herd were examined by AGID, ELISA and RT-PCR. The agreement of the three tests was obtained for 62 % of the samples, twenty-seven were positive and four were negative. The AGID and the ELISA assays failed to identify eight infected animals, which were positive in RT-PCR assay. On the other hand, four animals were positive in the serological assays and negative in RT-PCR. ELISA test showed higher sensibility than AGID; however it reproduced a negative false result and a positive one in relation to the other techniques. Lymphocytosis, a clinical sign of EBL, was present in three blood samples. This study demonstrates that AGID and ELISA could be used as screening tests in a control program of EBL. In these assays, the negative results from infected herds should be confirmed or refused by RT-PCR.