| dc.description.abstract | Resumo : Durante o desenvolvimento do sistema nervoso, as células precursoras nervosas migram para seus destinos finais e os axônios são direcionados ao longo de um trajeto até que encontrem seus alvos, com os quais estabelecem contatos especializados. Durante sua navegação em direção ao alvo, axônios interagem com moléculas da matriz extracelular e de superfície celular, as quais sinalizam o direcionamento axonal. Nesse contexto, eventos de adesão célula-célula e célulamatriz, bem como a proteólise da matriz extracelular são fundamentais para o desenvolvimento e a manutenção estrutural e funcional do sistema nervoso. ADAMs são proteínas transmembranas tipo I envolvidas tanto em eventos de adesão quanto na proteólise. ADAM23 é um membro dessa família expressa principalmente no SNC, tanto de embriões quanto de adultos, com função potencial de adesão célulacélula e célula-matriz extracelular, podendo estar envolvida no desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso. Animais nocaute para o gene que codifica essa proteína apresentam fortes tremores e ataxia e, sobrevivem no máximo duas semanas após o nascimento. Tal fato sugere que ADAM23 possa realmente ter uma importante função biológica no desenvolvimento do sistema nervoso. Com base nessas informações, o presente trabalho teve como objetivo expressar e purificar essa proteína e utilizá-la como antígeno na produção de anticorpos policlonais. Espera-se que essas ferramentas possam ser empregadas em ensaios bioquímicos e funcionais com o intuito de elucidar alguns dos papéis desempenhados pela ADAM23 no desenvolvimento e manutenção do SNC. Diferentes domínios da proteína ADAM23 humana foram expressos em sistema heterólogo de Escherichia coli fusionados à proteína Glutationa S-Transferase de Schistosoma japonicum a partir do vetor de expressão pGEX-2T. Extratos de células bacterianas foram submetidos a purificação por adsorção à matriz cromatográfica Glutationa Sepharose sob condições nativas. Somente a construção correspondente ao domínio desintegrina (construção 2, aa 499-585) pôde ser purificada satisfatoriamente e utilizada na imunização de camundongos. A eficiência do soro imune foi avaliada pelo método de ELISA e Western Blotting, no entanto o soro não se mostrou eficiente no reconhecimento de ADAM23 endógena nem de 6HisADAM23. Já as construções correspondentes ao domínio metaloprotease (construção 1, aa 293-496) e a ambos os domínios (construção 3, aa 293-585) não puderam ser purificadas, pois permaneceram em corpos de inclusão. Modificações no protocolo original foram realizadas para o domínio metaloprotease na tentativa de solubilizar a proteína, entre essas modificações empregou-se diminuição na concentração do agente indutor, mudança no detergente usado no tampão de lise, adição de agente desnaturante. No entanto não foi possível obter quantidades significativas da proteína na forma solúvel. Uma outra tentativa com a proteína recombinante do domínio metaloprotease, foi a solubilização da fração insolúvel com a utilização de sarcosil. Foi possível solubilizar grande parte das proteínas, no entanto não houve ligação à matriz cromatográfica, provavelmente por influência do sarcosil, que é um detergente iônico. Portanto, somente a construção referente ao domínio desintegrina pôde ser purificada e utilizada para a produção de anticorpos, que, no entanto, se mostraram ineficientes, devido à resposta ter sido gerada contra a proteína GST, que possui mais aminoácidos. Com isso, as persperctivas do projeto são melhorar as condições de purificação das proteínas correspondentes ao domínio metaloprotease e a ambos os domínios, para que se possam obter anticorpos mais eficientes, visto possuírem maior massa molecular. E com essas ferramentas poder se estudar algumas funções da ADAM23. | pt_BR |
