A análise polifásica na reclassificação genética de Rhizobium etli e o estudo da diversidade genética de isolados dos cerrados brasileiros

Abstract

Resumo: Depois da água, o nitrogênio (N) é o principal elemento nutricional limitante para a produção vegetal nos diferentes ecossistemas. O fertilizante nitrogenado se tornou então, um produto essencial para o manejo de culturas comerciais mas de alto custo, dificultando o acesso por parte de pequenos produtores, como é o caso dos plantadores de feijão. Neste contexto, a fixação biológica do nitrogênio (FBN) representa uma alternativa para satisfazer a demanda deste importante nutriente, tanto para ecossistemas agrícolas como para naturais. Conhecer todos os fatores implicados na manutenção desta prática se torna de suma importância, pois, além de colaborar para uma agricultura sustentável, auxilia nas investigações acerca da diversidade de espécies que podem representar a veracidade das características da microbiota dos solos brasileiros. Nesta investigação foram conduzidos dois estudos de caracterização genética bacteriana. No primeiro, quatro avaliações foram aplicadas (perfil de lipopolissacaródeo-LPS, análise de agrupamento dos produtos obtidos por rep-PCR, sequenciamento do gene ribossomal 16S e capacidade de nodulação e fixação de N2) em 93 isolados para analisar a diversidade de bactérias capazes de nodular o feijoeiro sob distintos manejos de solo (áreas cultivadas com leguminosas, áreas cultivadas sem leguminosas e áreas de solo coberto com vegetação natural) em 20 diferentes áreas dos Cerrados. Neste trabalho foi possível verificar, através do cálculo dos índices de diversidade e riqueza genética, que a diversidade genética bacteriana dos solos dos Cerrados em equilíbrio altera rapidamente em função das práticas de manejo de solo. Pelo sequenciamento de 16S rRNA, foi confirmado que bactérias pertencentes à subclasse beta são capazes de nodular e fixar N2 com o feijoeiro. No segundo estudo conduzido por esta investigação, bactérias classificadas em Rhizobium etli por sequenciamento do 16S rRNA, foram comparadas pela análise de RFLP-PCR dos genes de nodulação e fixação. Uma análise polifásica também foi construída com os resultados obtidos para cada gene digerido com seis diferentes enzimas (MspI, HinfI, RsaI, HhaI, NdeIII e MboII). Pela análise de RFLP-PCR dos genes nodA, nodB, nodC e nifH foi possível verificar que as estirpes brasileiras de R. etli sempre formaram um grupo distinto, ainda que com varabilidade intra-específica. Na análise polifásica incluindo os genes nodA, nodB, nodC e nifH, os grupos referentes às diferentes espécies foram evidenciados. As estirpes de R. tropici e rhizobium sp. formaram um agrupamento bastante heterogêneo, com um nível final de similaridade de apenas 40,7%. As estirpes brasileiras de R. etli foram agrupadas com 64,1% de similaridade e R. etli CFN 42 se uniu a esse grupo em 53,7%. Já o grupo de R. etli isolado da Espanha foi bastante distinto. Os resultados indicam que a população estabelecida nos solos de Cerrados foi caracterizada pela diversidade elevada quanto às propriedades fisiológcas, simbióticas e genéticas e que os R. etli brasileiros precisam ser mais profundamente avaliados, pois pode representar uma nova sub-espécie num futuro próximo.

Abstract: Water is the most limiting factor in agriculture, usually followed by nitrogen (N). Nfertilizer has thus become essential for the management of commercial crops, but its high cost often implicates in a low usage by small farmers, as those growing common bean (Phaseolus vulgaris). In this context, biological nitrogen fixation (BNF) represents an alternative source to supply N at a low cost. However, the maximization of BNF depends on short, medium and long-time research, and studies aiming at increasing the knowledge about the community of microsymbionts in the soils fit into this last category. The main objective of this work was to perform two studies aiming at the characterization of rhizobia associated with the common bean crop in Brazilian soils. In the first study, the diversity of 93 common bean microsymbionts from the Cerrados soils was evaluated using four methodologies: profiles of lipopolysaccharides (LPS), DNA amplification by rep-PCR (polymerase chain reaction) with the BOX "primer", sequencing of bases of the ribosomal 16S gene and capacity of nodulation and BNF. Common bean plants were used to trap the isolates from ten areas covered with natural vegetation, from five areas cropped with nonlegumes and from five areas growing legumes, but none with bean. The sequencing analysis indicated that bacteria belonging to the genus Burkholderia are capable of nodulating beans and in this study they represented the majority of the isolates in undisturbed areas, while rhizobia predominated in cropped areas. Using the BNF process as a model, a high level of diversity was shown in all areas, however, diversity and richness indices drastically decreased with crop introduction, particularly when growing legumes. Contrarily, cropping resulted in a fast selection of microsymbionts with higher capacity of BNF, especially in the presence of legumes. Three important points were highlighted in this study: 1) a need of maintaining undisturbed areas to preserve the biodiversity of the Cerrados; 2) that when the ecosystem equilibrium is broken there is an immediate process of selection and adaptation of the bacteria aiming at, within the potential of the community, the crop sustainability; 3) that biodiversity is not necessarily associated with the sustainability of commercial crops. In the second study, nodulation (nodA, nodB e nodC) and N2 fixation (nifH) genes of Brazilian strains of Rhizobium etli were analysed by RFLP (restriction fragment lenght polymorphism)-PCR with six restriction enzymes. The Brazilian strains of R. etli were clustered in a group isolated from other bean rhizobia species, but with high intra-species variability. The group of Brazilian strains showed higher similarity, although at low levels, with type-strain CFN 42 from Mexico, being considerably different from R. etli from Spanish soils. A hypothesis was proposed that R. etli was introduced in Brazil via seeds from indigenous populations of Mesoamerica, before European colonization. Later, R. tropici was introduced via migration from center-south Andes and due to its higher adaptability to the environmental conditions in Brazil it has became the preferential symbiont of common bean; however, R. etli persists in Brazilian soils.