Monitoramento da atividade de enzimas do complexo celulolítico utilizando celulose bacteriana covalentemente tingida com azul brilhante de Remazol R.

Abstract

Resumo: O cultivo de colonias de Gluconacetobacter xylinus, convenientemente isoladas a partir de fermentado acetico de vinho tinto em meio caldo Alabama modificado, produziu membranas de celulose bacteriana (CB), as quais foram purificadas atraves de tratamento anionico, confirmado por tecnica de reflexao total atenuada no infravermelho medio. A CB possui diversas vantagens quando comparada com a vegetal, ja que suas fibras sao orientadas de forma randomica, fazendo com que ela possua rapida hidrolise com microrganismos que possuam complexos celuloliticos, propriedade esta explorada no presente trabalho. A utilizacao de fruto-oligossacarideos como fonte alternativa de carbono para crescimento e producao de membranas de CB, utilizando cepa padrao de G. xylinus ATCC 23769, mostrou eficiente aumento no crescimento celular, tanto para o hidrolisado parcial de inulina citrico quanto fosforico (pH 2,5, temperatura de 95 ‹C, tempos 5 e 25 minutos) comparativamente aos cultivos contendo os monossacarideos glucose e frutose. As membranas de CB previamente purificadas foram trituradas e tingidas covalentemente com o corante Azul Brilhante de Remazol R com o objetivo de agir como substrato cromogenico para a deteccao e mensuracao da atividade de enzimas do complexo celulolitico. A ligacao covalente entre o grupo sulfito do corante e o carbono 6 das unidades de anidroglucose, foi confirmado por tecnicas espectroscopicas de ressonancia magnetica nuclear, tanto de nucleos 13C quanto 1H. As peliculas de CB covalentemente tingidas ou nao, foram submetidas a processo de sacarificacao frente a ataque de enzimas celulases de Trichoderma reesei (endo-glucanases e celobiohidrolases) e ƒÀ-glucosidade concentrada de Aspergillus niger em quantidades equivalentes. Atraves de planejamento fatorial 22 em estrela tendo como variaveis a temperatura de hidrolise (entre 26-56 ‹C) e proporcao entre estas enzimas (variando entre 23:77-77:23), observa-se que apos 72h a CB in natura possui maior potencial hidrolitico seguida pela CB Azure, que os substratos papel de filtro Whatman n.1, celulose micro-cristalina, algodao hidrofilo e bagaco de cana-de-acucar tingidos, ou nao. O ensaio de potencial de sacarificacao das enzimas tambem mostra que a CB in natura necessita menor carga enzimatica para a liberacao de 2 mg de acucares redutores, seguida pela CB Azure, sendo esta mais hidrolisavel que o papel de filtro Whatman n.1, substrato padrao para esse tipo de ensaio. Em segundo planejamento fatorial 22 em estrela, alterando temperatura de hidrolise (entre 36-64 ‹C) e a velocidade de agitacao (entre 80- 240 rpm) dos incubados, apos 1h de hidrolise de CB, a temperatura foi a variavel mais significativa para o aumento na porcentagem de liberacao de acucares redutores. A cinetica de hidrolise do substrato CB Azure, confirmou correlacao entre a liberacao dos produtos nao tingidos vs. tingidos, atraves de teste estatistico de correlacao de Pearson (r 0,9856) e teste t com nivel de confianca de 99%. Tecnicas de cromatografia em camada delgada foram utilizadas para avaliar os produtos de hidrolise confirmando a liberacao principalmente de glucose livre, seguida de celobiose, e dos produtos Azure, glucose-RBB e celobiose-RBB.

Abstract: Colonies cultivation of Gluconacetobacter xylinus, conveniently isolated from the acetic fermentation of red wine, in modified medium Alabama produced bacterial cellulose (BC) membranes, which were purified by anion treatment, confirmed by attenuated total reflection technique of mid-infrared spectroscopy. The BC has several advantages when compared with the vegetal one. Their fibers are oriented randomly, causing it to have rapid hydrolysis with cellulolytic microorganisms complex, a property exploited in this work. The use of fructo-oligosaccharides as alternative carbon source for cultivation and BC production, using a standard strain of G. xylinus ATCC 23769, was shown efficiently increase in cell growth for citric as phosphoric acid inulin partial hidrolysate (pH 2.5, 95° C, 5 and 25 minutes) compared to media containing the monosaccharides glucose and fructose. The purified BC membranes were previously milled and than covalently dyed with Remazol R Brilliant Blue with the objective of acting as a chromogenic substrate for detecting and measuring the activity of cellulolytic enzymes. The covalent bind among sulphite dye group and anhydroglucose carbon 6 of cellulose was confirmed by 13C and 1H nuclear magnetic resonance spectroscopic technique. Pellicles of BC, covalently dyed or not, were subjected to saccharification process by cellulases enzymes of Trichoderma reesei (endo-glucanases and cellobiohydrolases) and â-glucoside concentrated from Aspergillus niger in equivalent amounts. Star factorial design 22 having as variables hydrolysis temperature (among 26-56 ° C) and enzymes proportion (ranging from 23:77 to 77:23), shown after 72h better hydrolytic potencial for in natura BC, followed by BC Azure, than filter paper Whatman n.1, microcrystalline cellulose, cotton and sugar cane bagasse, dyed or not. The saccharification enzymes potencial test shown that in natura BC also requires fewer enzymes load for release 2 mg of reducing sugars, followed by BC Azure, which is easily hydrolyzable than the filter paper Whatman n.1, standard substrate for this test. A second star factorial design 22, changing hydrolysis temperature (among 36-64 ° C) and agitation speed (ranging from 80 to 240 rpm) of the incubated, after 1h hydrolysis of BC, the temperature shows be the most significantly variable to increase the percentage of reducing sugars release. The hydrolysis kinetics of BC Azure confirmed correlation among the release of undyed (reducing sugars) and dyed products through statistical Pearson correlation (r of 0,9856) and t with confidence level of 99%. Thin thin layer chromatography technique were used to measure the mainly hydrolysis products, glucose and cellobiose, and Azure products, glucose-RBB and cellobiose-RBB.