Tratamento combinado de temozolomida e sinvastatina tem ação citotóxica e altera a formação de neuroesferas em linhagem de glioblastoma humano

Abstract

Resumo: Gliomas são os tumores mais comuns derivados do Sistema Nervoso Central. Dentre seus tipos, o glioblastoma (GBM) é o mais agressivo e que apresenta pior prognóstico, com tempo de sobrevida dos pacientes que varia de 12 a 15 meses. O tratamento para GBM consiste na retirada cirúrgica da massa tumoral, seguida de radioterapia e quimioterapia, sendo a temozolomida (TMZ) a droga padrão utilizada. No entanto, apesar das estratégias terapêuticas atuais, esse tipo de tumor frequentemente se mostra resistente, apresentando altas taxas de recorrência. Um dos motivos dessa recidiva justifica-se pela presença das CSCs (Cancer Stem Cells). Essas células possuem propriedades características de células tronco, como a capacidade de crescer in vitro como agregados celulares, através do cultivo em substratos não aderentes, meios de cultura definidos, crescimento em constante movimento e ainda por meio das hanging drops. A técnica de hanging drop baseia-se no cultivo das células que ficam suspensas em uma tampa de placa de cultura devido à tensão superficial, então a gravidade induz a agregação de células. Hipóteses atuais sugerem que as CSCs seriam as responsáveis pela recidiva da massa tumoral, mesmo após o tratamento, já que esse é direcionado às células tumorais já diferenciadas. Nesse sentido, a procura por terapias combinadas que atinjam tanto as células diferenciadas quanto as CSCs torna-se uma alternativa interessante aos tratamentos atuais. Dados na literatura mostram uma correlação entre o uso das estatinas e uma menor incidência de gliomas. Os efeitos anti-tumorais da sinvastatina (SVA) tem sido investigados, no entanto ainda não se sabe qual sua ação em células tronco tumorais. Sendo assim, os objetivos desse trabalho foram: padronizar condições de cultivo de CSCs e investigar quais os efeitos do tratamento conjunto de TMZ e SVA nessa subpopulação de GBM. Primeiramente, foi demonstrado que o cultivo das células U87MG por 3 dias em hanging drop e 5 dias em substrato não aderente foi capaz de enriquecer a neuroesfera em CSCs, através da presença do marcador CD133 em microscopia confocal e aumento da expressão de CD133, CD15 e Sox-2, por q-PCR. Essas esferas enriquecidas, quando tratadas com a combinação de fármacos, não sofreram diminuição de tamanho, porém tiveram sua morfologia alterada após tratamento com SVA e TMZ+SVA. Ainda, o uso da SVA e a combinação de TMZ e SVA foi capaz de impedir a formação das esferas quando adicionados durante o período de 72h em hanging drop. Em paralelo, foi realizado o cultivo de CSCs de GBM com o meio definido NSC e foram também avaliados os efeitos da combinação dos fármacos nas esferas formadas. Foi visto um padrão de diminuição no número e no tamanho das esferas formadas, aumento da dupla marcação de anexina e PI e diminuição da expressão de CD133, CD15 e Sox-2 após tratamento conjunto TMZ e SVA. Nossos resultados mostram a efetiva padronização da metodologia de hanging drop e substrato não aderente para o cultivo das CSCs de GBM e também a potencialização do efeito citotóxico da TMZ quando em conjunto com a SVA nas neuroesferas de GBM. Palavras-chave: Glioblastoma. Células tronco tumorais. Neuroesferas.

Abstract: Gliomas are the most common tumors derived from the Central Nervous System. Among its types, glioblastoma (GBM) is the most aggressive, with median survival ranging from 12 to 15 months. Treatment for GBM consists of maximal surgical resection followed by radiotherapy and chemotherapy, with temozolomide (TMZ). However, despite current therapeutic strategies, this type of tumor is often resistant, presenting high rates of recurrence. One of the reasons for this recurrence is justified by the presence of CSCs (Cancer Stem Cells). These cells present properties of stem cells, such as the ability to grow in vitro as cell aggregates, through non-adherent substrates culture, defined culture media, growth in constant movement and through hanging drops. The hanging drop technique is based on culturing cells suspended in a plate cap due to surface tension, and then gravity induces cell aggregation. Current hypotheses suggest that CSCs are responsible for restructuring tumor mass, even after treatment, since current therapies are directed to already differentiated tumor cells. In this sense, the search for combined therapies that aim differentiated and non-differentiated tumor cells become an interesting alternative to current treatments. Some studies show a correlation between the use of statins and a lower incidence of gliomas. The antitumor effects of simvastatin (SVA) have been investigated, however it is not yet known what are their action on tumor stem cells. Therefore, this work's objectives were to standardize conditions for CSC culture and investigate the effects of the combined treatment of TMZ and SVA in CSCs of GBM. First, U87MG cells were cultured for 3 days in hanging drop and 5 days on non-adherent substrate, this protocol was shown to enrich the neurosphere in CSCs by the presence of CD133 marker in confocal microscopy and increased expression of CD133, CD15 and Sox-2, by q-PCR. These enriched spheres were treated with the combination of drugs, but did not showed decrease in their size. However, their morphology was altered when treated with SVA and TMZ + SVA. Also, the SVA and the combination of TMZ and SVA was able to inhibit the formation of spheres when plated in hanging drop. In parallel, culture of GBM CSCs with the defined medium NSC was performed and the effects of the combination of both drugs on the spheres formed were evaluated. A decreasing pattern in the number and size of spheres formed was observed, with an increase in the levels of annexin and PI, and a decrease on CD133, CD15 and Sox-2 mRNA expression after TMZ and SVA treatment. Our results show the effective standardization of the hanging drop and non-adherent substrate technique for GBM CSCs culture and also the potentiation of the cytotoxic effect of TMZ when combined with SVA in GBM neurospheres. Key-words: Glioblastoma. Cancer Stem Cells. Neurospheres.