A expressão muscular de HSP70 reflete estresse salino nos cristáceos braquiúros callinectes danae e Callinectes ornatus (osmorreguladores) e Hepatus pudibundus (osmoconformador)?

Abstract

Resumo: O longo tempo de evolução dos crustáceos (~500 milhões de anos) em conjunto com fatores evolutivos, como mutação, seleção natural e o fluxo gênico entre populações, permitiu uma enorme variação de formas e no preenchimento de nichos ecológicos por parte destes animais, sendo que em torno de 90% das espécies conhecidas são encontradas no mar ou em águas salinas, como estuários. Qualquer que seja o seu habitat, a osmorregulação é de vital importância para a sobrevivência dos crustáceos, pois ela garante a homeostase do líquido extracelular, mesmo diante de variações na salinidade da água. Essas alterações de salinidade responsáveis pelo desequilíbrio osmótico do líquido extracelular podem impactar no funcionamento normal das células, que por sua vez, ativam respostas celulares, entre elas a possível síntese de proteínas de choque térmico, entre elas a Hsp70. O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão de Hsp 70, acompanhar a osmolalidade da hemolinfa e comparar a capacidade de hidratação muscular em três espécies de decápodes braquiúros: Callinectes danae, Callinectes ornatus e Hepatus pudibundus diante de desafios salinos. O fato de que as espécies do gênero Callinectes serem osmorreguladoras e H. pudibundus apresentar a estratégia de osmoconformação pode se refletir na expressão diferenciada da síntese de Hsp70 em resposta a um agente estressor. Para tanto, os animais foram expostos a choque hiposalino (20‰) e hipersalino (45‰) em intervalos com duração de 6 horas, 24 horas e 72 horas para cada espécie. Após a exposição, foram retiradas amostras da hemolinfa para posterior análise de osmolalidade, além de amostras de tecido muscular para determinação do teor de hidratação e para análise da expressão de Hsp70. Também foram analisadas as concentrações de amônia e o valor de pH na água no início e ao final de cada experimento para determinar se a concentração de amônia em determinado valor de pH poderia ser tóxica a ponto de desestabilizar o processo de osmorregulação. A hipótese de que H. pudibundus teria menor expressão constitutiva de Hsp70 não foi comprovada, mas a hipótese de que C. danae e C. ornatus apresentariam maior expressão de Hsp70 do que H. pudibundus diante ambos os choques salinos comprovou-se verdadeira, ao menos com relação a C. danae e condicionada a um tempo de exposição ao agente estressor de pelo menos 72 horas. As espécies C. danae e C. ornatus (osmorreguladoras fracos) e H. pudibundus (osmoconformador), apresentaram neste estudo grande capacidade de manutenção da osmolalidade da hemolinfa diante de redução de salinidade, ao menos por um período de poucas horas. Todas as três espécies apresentaram comportamento osmoconformatório diante de aumento de salinidade, como o esperado. Em relação a capacidade de hidratação tecidual, C. danae e C. ornatus conseguiram, de forma geral, manter a sua hidratação tecidual diante de ambos os choques salinos, enquanto H. pudibundus apresentou diminuição significativa na quantidade de água no tecido muscular a partir de 24 horas de exposição em choque hipersalino. A concentração de amônia na água em conjunto com os valores de pH não podem ser admitidos como fatores que possam ter prejudicado a resposta das espécies ao estresse salino. A resposta à pergunta de que a expressão de Hsp70 poderia refletir estresse salino em C. danae, C. ornatus e H. pudibundus só pode ser plenamente respondida através da análise da expressão de Hsp70 em outros tecidos como brânquias e hepatopâncreas, além da utilização de diferentes intervalos de tempo de exposição ao estresse salino. Palavaras chaves: osmorregulação, crustáceos, Hsp70, hiposalino, hipersalino

Abstract: The long time evolution of crustaceans (~ 500 million years) along with evolutionary factors, such as mutation, natural selection and gene flow among populations, allowed a huge variation of forms and the filling of ecological niches by these animals. Around 90% of the known species of crustaceans are found in the sea or salt water, such as estuaries. Whatever their habitat, osmoregulation is of vital importance for the survival of crustaceans, as it ensures the homeostasis of extracellular fluid, even in the face of variations in salinity of water. These changes in salinity responsible for the osmotic imbalance of the extracellular fluid may impact on the normal functioning of the cells, which in turn activate cellular responses, among them the possible synthesis of heat shock proteins, like Hsp70. The objective of this study was to evaluate the expression of Hsp70, follow the hemolymph osmolality and to compare the muscle hydration capacity in three species of decapods: Callinectes danae, Callinectes ornatus and Hepatus pudibundus in the presence of saline challenges. The fact that species of the genus Callinectes are osmoregulatory and H. pudibundus presenting the osmoconformation strategy can be reflected in the differentiated expression of the synthesis of Hsp70 in response to a stressor agent. For this, the animals were exposed to hyposaline (20‰) and hypersaline (45‰) shock at intervals of 6 hours, 24 hours and 72 hours for each species. After exposure, hemolymph samples were taken for posterior osmolality analysis, as well as muscle tissue samples for determination of hydration content and analysis of Hsp70 expression. Ammonia concentrations and pH in water were also analyzed at the beginning and at the end of each experiment, to determine if the concentration of ammonia at a certain pH value could be toxic to the point of destabilizing the osmoregulation process. The hypothesis that H. pudibundus would have lower constitutive expression of Hsp70 has not been proven, but the hypothesis that C. danae and C. ornatus would present higher expression of Hsp70 than H. pudibundus exposed to salt shocks proved to be true, at least With respect to C. danae and conditioned to a exposure to the stressor of at least 72 hours. C. danae and C. ornatus (weak osmoregulators) and H. pudibundus (osmoconformer) presented in this study a great ability to maintain hemolymph osmolality in the presence of salinity reduction, at least for a few hours. All three species presented behavior of osmoconformatores in exposure to increase of salinity, as expected. In relation to tissue hydration capacity, C. danae and C. ornatus were able to maintain their tissue hydration in the presence of both saline shocks, while H. pudibundus showed a significant decrease in the amount of water in the muscle tissue after 24 hours of exposure in hypersaline shock. The concentration of ammonia in the water together with the pH values can not be accepted as factors that may have impaired the response of the species to salt stress. The answer to the question that the expression of Hsp70 could reflect saline stress in C. danae, C. ornatus and H. pudibundus can only be fully answered by analyzing the expression of Hsp70 in other tissues such as gills and hepatopancreas, in addition to the use of different intervals of exposure to saline stress. Key words: osmoregulation, crustacean, Hsp70, hypo-regulation, hyper-regulation