Produção de bioferramentas para o estudo da deubiquitinase USP2

Abstract

Resumo: A ubiquitinação está envolvida em vários processos no organismo, desde ciclo celular até vias de sinalização de apoptose. Por esse amplo envolvimento, é de extrema importância uma fina regulação que é realizada por enzimas chamadas deubiquitinases (DUBs) que hidrolisam ligações isopeptídicas. Dentre todas as DUBs, USP é a família mais extensa tendo como membro USP2 que possui duas isoformas fruto de processamento alternativo: USP2a (de 69kDa) e USP2b (de 45kDa) que se diferenciam apenas na região N-terminal. Alguns estudos relacionam essas isoformas com a via da p53, miogênese, tumores de próstata, agressividade de tumores de mama e manutenção dos níveis de Na+ e pressão sanguínea. Apesar desses estudos, a distribuição tecidual da USP2 ainda não está completamente estabelecida. A presença de duas isoformas distintas de processamento e a inexistência de anticorpos comerciais que possam distinguir entre as duas isoformas justifica a produção de reagentes confiáveis para o estudo de USP2. Desde modo, o objetivo foi produzir anticorpo monoclonal, isoforma específico, para USP2a e clonar, produzir proteína recombinante em bactérias e superexpressar USP2b em células eucariontes. USP2a foi produzida em E. coli BL21(DE3)STAR fusionada com etiqueta de histidina e purificada por coluna de Ni-NTA. A proteína purificada foi usada para imunizar camundongos balb/c. O soro policlonal desses animais foi testado por western blot para a presença de anticorpo anti-USP2a quanto ao reconhecimento da proteína endógena e superexpressa em linhagens de próstata LNCaP e RWPE-1 tendo dois animais positivos usados para a fusão com mieloma. Os hibridomas após a diluição limitante foram varridos por ELISA chegando-se a um clone 4GD2 que reconheceu USP2a superexpressa em HEK293T e não reconheceu USP2b superexpressa em HEK293T, indicando que obteve-se sucesso na produção de um anticorpo monoclonal isoforma específico para USP2a. Além disso, a isoforma USP2b foi clonada com sucesso nos vetores pET28a(+) e pcDNA3.1(-)6his. Esta isoforma não foi expressa em E. coli mesmo com várias mudanças no sistema, desde cepa bacteriana até temperatura, meio e tempo de expressão, mas foi superexpressa em HEK293T. As ferramentas produzidas serão de extrema importância para estudos de mapeamento tecidual, análise de cinética e busca de novos parceiros moleculares para essas isoformas. Palavras-chave: USP2, USP2a, USP2b, anticorpo monoclonal, proteína recombinante.

Abstract: Several physiological processes involve ubiquitylating modification, from cell cycle to apoptosis pathways. Because this involvement has a large range, it is extremely important that this post-translational modification be tightly regulated. Enzymes called deubiquitinases (DUBs) hydrolyze isopeptide bond and have a pivotal role in this regulation. Among all DUBs, the USP is the largest family. USP2, a member of this family, has two isoforms from alternative splicing: USP2a (69kDa) and USP2b (45kDa) and differences rely within their N-terminal regions. These isoforms have related to p53 pathway, myogenesis, prostate tumors, breast tumors aggressiveness and maintenance of Na+ levels and blood pressure. Despite these studies, the tissue distribution of USP2 is not completely established. Absences of commercial antibody that recognize specific isoforms justify the production of reliable reagents to study USP2. Thus, the aims of this study were (1) to express both USP2a and USP2b in heterologous bacterial system; (2) to overexpress USP2b in mammalian cells and (3) to produce monoclonal antibodies specific to USP2a isoform. USP2a was produced in E. coli BL21(DE3)STAR fused with polyhistidine tag and purified by Ni-NTA column. The purified protein was used to immunize Balb/c mice strain. We have tested the polyclonal serum of these animals by western blot to the presence of antibody anti-USP2a that recognize endogenous and overexpressed protein in prostate line LNCaP and RWPE-1. Two animals were positive and employed in fusion procedures. After hybridoma supernatant screenings for anti-USP2a presence by ELISA, we isolated the clone 4GD2, which was stable and still secreting antibodies after several freeze-thaw cycles. Monoclonal antibody 4GD2 recognizes USP2a overexpressed in HEK293T cells and does not cross-react with USP2b, suggesting that MoAb 4GD2 is highly specific. In addition, USP2b was successfully cloned in pET28a(+) and pcDNA3.1(-)6his vectors, both expression vectors for prokaryotic and eukaryotic systems, respectively. We were not able to express successfully USP2b in E. coli under different protocols (e.g. temperature, medium and time parameters changes), however we expressed His-tagged USP2b in HEK293T cells. The produced tools will be extremely important in further studies, such as tissue and temporal USP2 expression mapping, USP2 expression and disappearing kinetics in cell lines and characterization of new molecular partners for this DUB. Key words: USP2, USP2a, USP2b, monoclonal antibody and recombinant protein.