Sobrevivência em ramos e controle alternativo de Phyllosticta citricarpa, agente causal da mancha preta dos citros

Abstract

Resumo: A Mancha Preta dos Citros (MPC) é uma doença que ameaça a Citricultura brasileira, causando lesões em frutos e sua queda prematura em estágios mais severos, levando a prejuízos de produção e rejeição no mercado consumidor. É causada pelo fungo Phyllosticta citricarpa, presente em folhas caídas em decomposição na forma sexuada (ascósporos) e nas lesões dos frutos, em folhas aderidas à planta e ramos secos na forma assexuada (picnidiósporos). O uso de fungicidas sistêmicos ainda é a principal alternativa de controle, mas se depara com os principais problemas do seu uso excessivo como toxicidade ambiental, acúmulo de resíduos nos frutos e seleção de patógenos resistentes. A busca por um controle alternativo pode envolver microrganismos endofíticos de plantas medicinais, uma vez que é conhecido seu potencial biotecnológico e poder protetor da planta hospedeira, mas depende do conhecimento do ciclo infeccioso do patógeno sob vários aspectos. Sabe-se da importância do manejo de ramos secos no controle da doença mas pouco se conhece sobre a participação dos ramos na epidemiologia da MPC. Técnicas tradicionais de isolamento em meio de cultura juntamente com ensaios moleculares têm agilizado o diagnóstico de doenças, oferecendo dados importantes sobre vários patosistemas. Adicionalmente, o uso de microrganismos transformados geneticamente para expressão de uma proteína repórter, como a green fluorescente protein (gfp), trazem uma nova ferramenta para o monitoramento desses microrganismos e entendimento do seu ciclo infeccioso. No presente estudo foram avaliados 128 ramos de área de alta incidência da MPC, pertencentes a quatro estados fenológicos: novo, jovem, velho e seco. O isolamento destes tecidos revelou 1,6% de amostras positivas para P. citricarpa, apenas em tecidos de estado fenológico velho, enquanto a extração de DNA direto dos tecidos seguido de PCR espécie específico não revelou a presença do patógeno. Foi avaliada a sobrevivência do fungo patogênico em ramos de citros destacados, pela inoculação de suspensão conidial da linhagem transformante LGMF06-T2 (gfp) de P. citricarpa. Foi possível recuperar o fungo inoculado dos tecidos após 45 dias da sua inoculação, não sendo recuperado após 90 e 135 dias. A espécie inoculada foi confirmada por microscopia de fluorescência, e este resultado sugere a sobrevivência do patógeno nos ramos por pelo menos 45 dias. Adicionalmente, foi avaliado o efeito do extrato metabólico do fungo endofítico Diaporthe terebinthifolii sobre a formação de picnídios de P. citricarpa em ramos autoclavados. Fragmentos de 1 cm de ramos autoclavados foram depositados sobre meio ágar-agua e em suas laterais foram inoculados fragmentos miceliais do patógeno. Comparou-se o crescimento micelial e formação de picnídios nos ramos tratados com o extrato do fungo endofítico com relação aos ramos não tratados e ramos tratados com fungicida comercial. Observou-se que o extrato reduz a formação de picnídios comparativamente ao controle negativo, apresentando efeito similar ao promovido pelo fungicida. Tais resultados confirmam o potencial do extrato do fungo D. terebinthifolii no controle do patógeno P. citricarpa. Palavras-chave: Mancha Preta dos Citros, Phyllosticta citricarpa, endófitos, controle alternativo

Abstract: The Citrus Black Spot (CBS) is a threat to the Brazilian Citrus, causing fruit lesions and premature fruit drop in more severe cases, leading to yield losses and fruit rejection in the consumer market. CBS is caused by the fungus Phyllosticta citricarpa, which ascospores are the sexual stage, found in decomposing fallen leaves, and picnidiospores are the asexual stage, present in fruit lesions, attached leaves and dried branches. Systemic fungicides are the main control alternative, but its overuse causes problems like the environmental toxicity, residues accumulation in fruits and also the selection of resistant pathogens. The search of an alternative disease control method may involve endophytic microorganisms of medicinal plants, due to their biotechnological potential and protective power of the host plant, but it is important to know about the infectious cycle of the pathogen. We know the importance of handling dry branches for CBS control but there is a lack of information about this pathosystem, mainly about the influence of branches in the disease epidemiology. The use of traditional isolation techniques coupled with molecular techniques have enhanced the diagnosis of diseases, providing important data on the interaction between the plant and the pathogen. Additionally, the use of genetically transformed microorganisms for the expression of a reporter protein, such as green fluorescent protein (GFP) brings a new tool to understand the pathogen infectious cycle. In the present study, we evaluated 128 branches in area of high incidence of CBS, belonging to four growth stages: new, young, old and dried. The isolation of these tissues showed 1.6% of samples with the presence of P. citricarpa, only in branches in old growth stages, while the method used for DNA extraction and PCR directly from the branches tissue did not reveal the pathogen. We also evaluated the fungus survival in detached citrus branches by inoculating a conidial solution of the LGMF06-T2 transformed strain expressing the green fluorescent protein (GFP). The pathogen was reisolated from the branches after 45 days of inoculation, with the gfp strain confirmed by fluorescence microscopy. These findings suggests that the pathogen can survive in branches for at least 45 days. Additionally, we evaluated the control effect of metabolic extract of the endophytic fungus Diaporthe terebinthifolii over micelial growth and pycnidia formation of P. citricarpa in autoclaved branches. Branches fragments (1 cm) were placed on water agar media and mycelium fragments of the pathogen were inoculated on its sides. It was evaluated the micelial growth and pycnidia formation on the branches treated with the the endophytic fungus extract, compared with non-treated branches and branches treated with commercial fungicide. The extract treatment reduced the formation of pycnidia compared to the non-treated branches, and its inhibition was similar to the fungicide treatment. These findings confirm the potential of D. terebinthifolii extract in the control of P. citricarpa. Keywords: Citrus Black Spot, Phyllosticta citricarpa, epidemiology, disease control, endophytes, alternative control