Variabilidade genética de HLA-G, HLA-E e MICA e a expressão de moléculas HLA-G/-E, MICA/B e ULBP-2 solúveis totais e carreadas por vesículas extracelulares em casos de falha de implantação embrionária e controles férteis

Abstract

Resumo: Repetidas falhas de implantação embrionária são um sério problema para as clínicas de medicina reprodutiva. Consequentemente, marcadores diagnósticos, que em última análise auxiliariam na prática clínica, são desejáveis. Sinais imunomoduladores circulantes, liberados durante a gestação, como as moléculas HLA (HLA-G/-E) e tipo-HLA (MICA/B e ULBP-2) em suas formas solúveis e secretadas via vesículas extracelulares (EVs), promovem a sinalização intercelular para desenvolvimento embrionário. Este estudo investigou a associação entre a variabilidade dos genes HLA-G/-E e MICA e o perfil de expressão de HLA-G/-E, MICA/B e ULBP-2 em sangue periférico nas suas duas formas solúveis, total e carreadas por EVs, em casos de falha de implantação embrionária e controles férteis. Participaram deste estudo 62 casais com pelo menos duas falhas de implantação embrionária (IF); 131 casais férteis não gestantes com pelo menos duas gestações normais, sem relato de complicações (FW) e 29 mulheres férteis gestantes (PW). ExoQuik, ultracentrifugação, Western blot, Nanoparticle Tracking Analysis e citometria de fluxo foram utilizados para caracterização de EVs. ELISA foi utilizado para a quantificação das citocinas TGF-?1, IL-10 e IFN-y e das moléculas HLA-G/-E, MICA/B e ULBP-2 em suas isoformas solúveis totais e carreadas por EVs. A genotipagem dos genes HLA-G/-E e MICA foi realizada por sequenciamento, SSOp e SSP. Este estudo evidenciou a concentração aumentada das citocinas TGF-?1 e IL-10 e a capacidade de intensificar a atividade de caspase-3 em células NK CD56dim citotóxicas em EVs derivadas de mulheres gestantes. Além disso, sugeriu a existência de associações de potenciais marcadores genéticos e de seus níveis de expressão em casos de falha de implantação, como: (i) a maior frequência do alelo HLA-G 14pb del e níveis aumentados de HLA-G solúvel (sHLA-G) total; (ii) os haplótipos HLA-G*01:01:08/14pb del e HLA-G*01:04:01/14pb del como prováveis haplótipos de risco; (iii) o haplótipo HLA-G*01:01:01/14pb del associado à níveis elevados de sHLA-G total e vesicular e o haplótipo HLA-G*01:01:02/14pb ins associado à níveis reduzidos de sHLA-G vesicular. Não foram encontradas diferenças em relação à diversidade alélica e genotípica e níveis de expressão de HLA-E. Em relação às moléculas ligantes do receptor NKG2D, os alelos MICA*002:01, MICA*004:00 e MICA*008:01/04 estão associados a níveis de MICA solúvel total independente das condições dos grupos de estudo. Além de corroborar a importância das EVs em gestações normais e patológicas, este estudo evidenciou a importância das variações nas sequências gênicas na regulação dos níveis de expressão de proteínas importantes no contexto imunológico, como HLA-G e MICA. No entanto, mais estudos que auxiliem no esclarecimento dos possíveis fatores de suscetibilidade e proteção relacionados a essas moléculas e seu papel em casos de falhas implantacionais e demais complicações gestacionais são necessários.

Abstract: Recurrent embryo implantation failure remains a serious problem of modern assisted reproductive technologies outcome. Consequently, diagnostic markers, which can assist clinical practice, are desirable. Immunomodulatory signals are released during pregnancy via HLA (HLA-G/-E) and HLA-type (MICA/B and ULBP-2) molecules in distinct released forms, as total soluble molecules or secreted via extracellular vesicles (EVs), promoting intracellular signaling for embryo development. The aim of this study was to investigate the variability of the HLA-G/-E and MICA genes and the expression profile of the HLA-G/-E, MICA/B and ULBP-2 molecules in its total soluble and secreted via EVs forms, in embryo implantation failure and fertile controls. Therefore, we included in the study 62 couples with at least two embryo implantation failures (IF); 131 non-pegnant fertile couples with at least two normal pregnancies with no reporting complications (FW) and 29 fertile pregnant women (PW). ExoQuik, ultracentrifugation, Western blot, Nanoparticle Tracking Analysis and flow cytometry were used for EVs characterization. ELISA was performed for the quantification of the TGF-?1, IL-10 e IFN-y cytokines and HLA-G/-E, MICA/B e ULBP-2 molecules. The genotyping of HLA-G/-E and MICA genes was performed by sequencing, SSOp and SSP techniques. As main results, we showed increased levels of TGF-?1 and IL-10 cytokines and the ability to enhance the caspase-3 activity in cytotoxic CD56dim cells in EVs derived from pregnant women. Furthermore, we suggested potential genetic markers and the association with their expression levels in implantation failure women, such as: (i) higher frequency of HLA-G 14bp del and increased levels of total soluble HLA-G (sHLA-G); the possible risk haplotypes HLA-G*01:01:08/14pb del and HLA-G*01:04:01/14pb del; (iii) the haplotype HLA-G*01:01:01/14pb del associated with increased levels of total and vesicular sHLA-G and the haplotype HLA-G*01:01:02/14pb ins associated with reduced levels of vesicular sHLA-G. There were no differences in the allelic and genotypic distribution and expression levels of HLA-E. Regarding to the NKG2D-ligands molecules, the alleles MICA*002:01, MICA*004:00 and MICA*008:01/04 are associated with total soluble MICA levels regardless of the study group conditions. In addition to corroborate the EVs importance in normal and pathological pregnancies, this study showed the importance of the gene sequences variances in the regulation of the expression levels of important proteins in the immunological context, such as HLA-G and MICA. However, further studies are needed to clarify potential susceptibility and protective factors related to these molecules and their role in cases of implantation failure and other pregnancy complications.