Aplicação de espectrometria de massa no controle de qualidade de inoculantes comerciais agrícolas contendo bactérias promotoras de crescimento vegetal

Abstract

Resumo: As rizobacterias promotoras do crescimento vegetal (PGPR) sao bactérias do solo benéficas para o crescimento de plantas e para a agricultura pois podem influenciar positivamente no rendimento da safra. Bactérias do gênero Azospirillum sao consideradas PGPR e vem sendo estudadas na aplicação em culturas de gramíneas. Inoculantes com estirpes Ab-V5 e Ab-V6 de Azospirillum brasilense ja sao comercializados para culturas de milho e trigo, alem de inoculantes contendo outras espécies de bactérias para culturas como a soja, cana-de-açúcar, feijão, entre outras. Por se tratar de um produto com material biológico, e preciso de um método de controle de qualidade eficiente na identificação de bactérias. A espectrometria de massa MALDI-TOF e um método eficiente, rápido e barato utilizado na identificação de microrganismos. Muitos estudos comprovam a identificação de bactérias de interesse clinico, contudo ha um aumento em estudos de interesse ambiental, agrícola e controle de qualidade, por exemplo. Tendo em vista o potencial dos inoculantes contendo bactérias promotoras do crescimento vegetal, do grande uso destes produtos pelos agricultores e o potencial do MALDI-TOF, o objetivo principal deste trabalho foi aplicar a técnica de MALDI-TOF MS na identificação de estirpes de bactérias para o controle de qualidade de inoculantes comerciais usados em culturas agrícolas. Como resultados, foram obtidos espectros de massa de MALDI-TOF de estirpes referencia FP2, Sp245, Ab-V5, Ab-V6, Ab-V7 de Azospirillum brasilense, DSM 1691 de Azospirillum lipoferum e BL21 de Escherichia coli como picos representativos para comparações com os picos dos isolados de inoculantes. Foi possível a separação de espécie e de estirpes de Azospirillum através da analise desses picos. Sete inoculantes de Azospirillum foram analisados seguindo o protocolo de controle de qualidade recomendado pela RELARE, não havendo sido constatado contaminação. Entretanto, um único inoculante atingiu o numero de células viáveis por mL recomendado e indicado no rotulo do produto. Colônias de cada meio e de cada diluição foram submetidos a analise em MALDI-TOF MS e cada inoculante obteve picos representativos que foram comparados aos picos das estirpes referencias. Um dos inoculantes foi misturado a cultura da bactéria Herbaspirillum seropedicae SmR1 marcada, na proporção de 1:1 (simulando uma contaminação), e os resultados mostraram que foi possível identificar a bactéria "contaminante" e diferencia-la das estirpes Ab-V5 e Ab-V6 de A. brasilense, contidas no inoculante, por comparação de espectros de massa. Plantas de milho foram inoculadas com A. brasilense Ab-V5 e inoculante comercial contendo esta mesma estirpe. As bactérias foram re-isoladas das raízes e a identidade da estirpe referencia foi confirmada por amplificação por PCR de fragmento estirpe-específico. Entretanto, não houve confirmação dos isolados a partir das raízes de plantas inoculadas com inoculante comercial. Palavras-chave: MALDI-TOF MS, inoculante, Azospirillum brasilense, controle de qualidade.

Abstract: Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) are beneficial microrganisms for growth plants and agriculture because they can posetively affect the crop field. Bacteria from genus Azospirillum are considered PGPR and they have been studied on aplication in grass crops. Inoculants with strains Ab-V5 and Ab-V6 of Azospirillum brasilense are already marketed for corn and wheat, as well as inoculants containing other species of bacteria for crops as soybean, sugar cane, bean and other. Because it is a prouct with biological material, it's necessary an efficient method of quality control in the identification of bacteria. Mass spectrometry MALDI-TOF is an efficient, fast and cheap method in the identification of microrganisms. Many studies show the use of the technique of clinic interest, however there is an increase of ambiental, agricultural and quality control studies, for example. In view of the potencial of the inoculants containing PGPR, the great useof theses products for farmers and the potencial of MALDI-TOF MS, our objective was apply the technique of identification of microrganisms by MALDI-TOF for quality control of comercial inoculants used in crop yields. As results, it was obtained mass espectra MALDI-TOF of referencestrains of FP2, Sp245, Ab-V5, Ab-V6, Ab-V7 of Azospirillum brasilense, DSM 1691 of Azospirillum lipoferum and BL21 of Escherichia coli as representative peaks for comparation with peaks from isolates of inoculants. It was possible to separate specie from specie and strain from strain of Azospirillum by analysis of those peaks. Seven inoculants of Azospirillum were analysed following quality control protocol recommended by RELARE, they have not presented contamination, just one inoculant reached the number of viable cells per mL that was indicated on the product label.Colonies of each medium and each diluition were submmited to MALDITOF analysis and each inoculant obtained representative peaks that were compared to the reference strains peaks. An inoculant was mixed with a labeled Herbaspirillum seropedicae SmR1, on 1:1 proportion (simulating contamination) and results have shown that was possible to identify "contaminant" bacterium and to differentiate from strains Ab-V5 and Ab-V6 for espectra comparison. It was inoculated in corn root A. brasilense Ab-V5 and comercial inoculant with same strain. Bacteria were re-isolated from root and the identification of reference-strain was confirmed by fragment specific-strain amplification. However it there wasn't success of identification at reisolated bacteria from root inoculated with comercial inoculant. Keywords: MALDI-TOF MS, inoculant, Azospirillum brasilense, quality control.