Desenvolvimento de biossensor para diagnóstico sorológico da hanseníase

Abstract

Resumo: A hanseníase é uma doença infecciosa negligenciada causada pelo Mycobacterium leprae que acomete a pele e os nervos periféricos. Dados da Coordenação Estadual do Programa de Vigilância e Controle da Hanseníase apontam que, no Brasil, são em média 46.270 novos casos por ano, colocando o Brasil no segundo pais com maior índice de prevalência. O que mais preocupa é a crescente incidência em menores de 15 anos (8,4%) o que indica a existência de adultos portadores do M. leprae disseminando a doença. Atualmente o diagnóstico da hanseníase é baseado em sinais e sintomas clínicos acompanhados, ocasionalmente, por exame baciloscópico. O teste sorológico disponível é baseado na detecção de anticorpos anti-PGL-I obtido a partir do próprio bacilo, o qual não é cultivável in vitro sendo obtido a partir da infecção de tatus. Em estudos realizados anteriormente, peptídeos selecionados por Phage Display foram capazes de identificar pacientes hansenianos por ELISA. Dando continuidade a esse trabalho, um desses peptídeos foi modificado em sua porção C-terminal com um linker espaçador SGSG e um resíduo de cisteína. Após síntese química, o peptídeo otimizado foi utilizado na padronização de um teste de ELISA qual se obteve sensibilidade de 95% de sensibilidade e 96% de especificidade. Constatada a sua reatividade após as modificações realizadas, um protocolo para implementação de um biossensor para diagnóstico da hanseníase foi desenvolvido utilizando-se microbalança de cristal de quartzo (QCM). As etapas de limpeza do sensor, imobilização do ligante ao sensor, preparação da amostra, procedimento de medição e avaliação do sensorgrama, fazem parte do fluxo de análise da QCM. Após medições de QCM obteve-se diferença de frequência para amostras positivas para hanseníase de 854 Hz, enquanto que para as amostras negativas, apenas 4 Hz. A sensibilização do sensor foi corroborada pelas imagens de MFA, que mostraram diferença de topografia do sensor após adsorção do peptídeo. O uso da QCM tem a vantagem da simplicidade do procedimento, resultado imediato, ausência de moléculas marcadoras além da possibilidade de miniaturização do teste. O desenvolvimento de imunoensaios que permitam o diagnóstico precoce da hanseníase é extremamente desejado, pois pacientes diagnosticados e tratados tardiamente podem apresentar incapacidades físicas e deformidades que podem levar a diminuição da capacidade de trabalho, limitação da vida social e problemas psicológicos e, mais importante, o diagnóstico precoce interrompe a transmissão, fazendo com que seja possível a eliminação da doença. Portanto, o biossensor aqui desenvolvido é um passo promissor para atingir esses objetivos.

Abstract: Leprosy is a neglected infectious disease caused by Mycobacterium leprae that affects the skin and peripheral nerves. Data Coordination Program State Surveillance and Control of Leprosy show that, in Brazil, are on average 46.270 new cases per year, putting Brazil in the second country with the highest prevalence. Of more concern is the increasing incidence in children under 15 years (8.4%), which indicates the presence of adults with M. leprae spreading the disease. Currently the diagnosis of leprosy is based on clinical signs and symptoms accompanied occasionally by smear. Serologic testing available is based on detection of anti-PGL-I obtained from the bacillus itself, which is not cultivable in vitro being obtained from the infection of armadillos. In previous studies, peptides selected by phage display were able to identify leprosy patients by ELISA. Continuing this work, one of these peptides was modified in their C-terminal portion with a linker SGSG spacer and a cysteine residue. After chemical synthesis, the peptide was optimized used in a standardized ELISA test which had a sensitivity of 95% sensitivity and 96% specificity. Found their reactivity after the changes made, a protocol for implementation of a biosensor for the diagnosis of leprosy was developed using quartz crystal microbalance (QCM). The steps of cleaning the sensor, the sensor ligand immobilization, sample preparation, measurement and evaluation procedure of sensorgram, part of the flow of QCM analysis. After measurements obtained QCM frequency difference samples positive for leprosy 854 Hz, while for negative samples, only 4 Hz sensitization of the sensor was confirmed by the images of AFM, which showed differences in topography of the sensor after adsorption peptide. The use of QCM has the advantage of simplicity of the procedure, immediate result, absence of marker molecules beyond the possibility of miniaturization of the test. The development of immunoassays that allow early diagnosis of leprosy is extremely desirable because patients diagnosed and treated late may have physical disabilities and deformities that may lead to decreased work capacity, restricted social life and psychological problems and, more importantly, Early diagnosis stops transmission, making it possible to eliminate the disease. Therefore, the biosensor developed here is a promising step toward achieving these goals.