Análise comparativa de expressão proteica entre amostras tumorais e não tumorais de carcinomas mamários

Abstract

Resumo: O câncer de mama é o tipo de câncer mais comum entre as mulheres e cerca de 57.000 novos casos são esperados para a população brasileira em 2015. Um conhecimento sólido sobre a expressão proteica é essencial para a compreensão biológica, diagnóstico precoce e tratamento do câncer de mama. Os principais objetivos deste trabalho foram identificar proteínas diferencialmente expressas entre amostras pareadas de carcinoma ductal invasivo e tecido não tumoral de mama, e na seleção de possíveis alvos, avaliar e comparar a expressão de RNAm e proteica de STIP1 entre amostras de tecido de mama tumoral, não tumoral e de linfonodo metastático. A análise proteômica comparativa foi realizada pelo método de eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida para cinco amostras pareadas, sendo consideradas apenas as bandas com diferença de expressão acima de duas vezes (p<0,05). As proteínas foram identificadas por espectrometria de massa (MALDI-TOF). A expressão de RNAm foi avaliada por PCR quantitativa em tempo real utilizando 53 amostras de tumor e oito de linfonodos metastáticos. Oito trios de amostras de tecido não tumoral, tumoral e linfonodo metastático tiveram a expressão de STIP1 comparada por western blotting (WB). A análise proteômica gerou 35 proteínas identificadas presentes em pelo menos duas amostras e, entre estas, as dez com maior variação de expressão foram: CASPE, ENOG, TPM1, CAPG, VIME, TPM3, TRFE, PDIA6, WDR61 e PDIA3. A expressão de RNAm de STIP1 foi maior na amostra de tumor em relação ao tecido não tumoral e ao linfonodo, enquanto a análise por WB mostrou aumento significante de expressão apenas entre tecido tumoral e não tumoral. Neste trabalho, identificamos mais de uma centena de proteínas diferencialmente expressas entre o tecido mamário não tumoral e tumoral, sendo muitas delas com participação já conhecida no câncer de mama enquanto outras ainda carecem de mais estudos. Entre elas encontra-se a proteína STIP1. A expressão de RNAm de STIP1 se mostrou aumentada nas amostras de tumor e linfonodo em relação ao controle não tumoral. Também houve aumento em nos linfonodos em relação aos tumores, mas não houve diferença significativa em relação a quaisquer outros parâmetros avaliados. STIP1 apresentou um aumento de expressão significativo no tecido tumoral em relação ao tecido não tumoral, mas não houve diferença na expressão de amostras de tumor e linfonodo metastático em análise por WB. Esses dados preliminares sugerem o aumento de expressão de STIP1 já no início da tumorigênese, permanecendo no processo metastático. Em conclusão, descrevemos várias proteínas diferencialmente expressas, discutindo a função de algumas pré-selecionadas no câncer de mama e avaliando a potencial utilização das mesmas como marcadores de diagnóstico e prognóstico. Este conhecimento é útil não só na carcinogênese mamária, mas na compreensão dos mecanismos básicos dos cânceres em geral.

Abstract: Breast cancer is the most common type of cancer among women worldwide, and about 57,000 new cases are expected for the Brazilian population in 2015. A solid knowledge of protein expression is essential for biological understanding, early diagnosis and therapeutics of breast cancer. The main objectives of this study were the comparisons between the proteome of paired samples of invasive ductal breast tumors and non-tumor tissues, selecting possible targets to evaluate and compare the mRNA and protein expression of STIP1 among samples from tumor, non-tumor and metastatic lymph node. The comparative proteomic analysis was performed by two-dimensional electrophoresis in polyacrilamyde gel using five paired samples and considering for analysis just the spots with an expression difference over two fold (p<0.05). The proteins were identified by mass spectrometry (MALDI-TOF). Quantitative real time PCR was used to evaluate mRNA using 53 tumor samples and eight metastatic lymph nodes. ACTB and GAPDH were used as housekeeping controls and a pool of non-tumor samples as a calibrator. Eight triplets' tumor, nontumor and lymph node tissues had the expression of STIP1 compared by Western Blotting (WB). The proteomic analysis identified 35 proteins common to at least two samples and, among them, the ten with the highest differences in expression were CASPE, ENOG, TPM1, CAPG, VIME, TPM3, TRFE, PDIA6, WDR61 and PDIA3. The STIP1 mRNA expression was higher in tumor samples than in non-tumor and lymph nodes. WB analysis showed a significant increase just between tumor and non-tumor samples. In the present work, we identified more than a hundred proteins with differential expression comparing tumor and non-tumor tissue, most of them with a recognized role in breast cancer and others needing more studies, like STIP1. The mRNA levels of STIP1 were different between tumor and normal control and between tumor and lymph node, but no difference was seen with all other parameters analyzed. STIP1 was significantly overexpressed in tumor tissue compared with nontumor but no difference was seen between tumor and metastatic lymph node in WB analysis. These preliminary data suggest the increase of STIP1 expression in early tumorigenesis, persisting during the metastatic process. In conclusion, we describe several differentially expressed proteins, discussing the function of pre-selected ones in breast cancer and evaluating their potential use as diagnosis or prognosis markers. This knowledge is useful not only to mammary carcinogenesis but also to the understanding of basic mechanisms of cancer in general.