Protocolos de criopreservação de sêmen em felídeos do gênero Leopardus e quantificação de metabólitos fecais de andrógenos e glicocorticóides

Abstract

Resumo: Foram testados a eficiência de novas biotecnologias da reprodução em jaguatiricas (Leopardus pardalis Linnaeus, 1758), gato-do-mato-pequeno (Leopardus tigrinus Schreber, 1775) e gato-maracajá (Leopardus wiedii Schinz, 1821). Quatro indivíduos de L. pardalis foram anestesiados em quatro a cinco ocasiões, com um intervalo de 30 dias, em um total de 17 procedimentos, com uma associação intramuscular (IM) de cloridrato de tiletamina-zolazepam (7 mg/kg) e xilazina (1 mg/kg). A combinação de tiletamina-zolazepam e xilazina proporcionou uma boa qualidade da anestesia, período de latência curto, bom período anestésico viável e segurança na eletroejaculação de L. pardalis, com boa qualidade de sêmen obtido. L. tigrinus (n=13) e L. wiedii (n=6) também foram submetidos a colheitas mensais de sêmen, com três a cinco repetições cada indivíduo. As amostras foram avaliadas e protocolos de criopreservação foram testados com diluentes comerciais (Bioxcell ®, em L. tigrinus; Andromed ® em L. tigrinus, L. wiedii e L. pardalis; Test Yolk Buffer ® em L. tigrinus, L. wiedii e L. pardalis) foram testadas também duas curvas de criopreservação: a) curva TK congelamento em equipamento automatizado (TK ® 3000) com taxas de refrigeração de - 0,25oC/min e de congelação de - 20°C/min e b) curva GEL com refrigeração e estabilização em geladeira 20°C à 5°C em duas horas e congelação numa caixa de isopor em 4 minutos em plataformas com 8 cm e 3 cm acima do nitrogênio, apresentando melhores resultados com diluente TYB associado à curva TK em todos os experimentos. A capacidade de detectar andrógenos fecais foi testada por dois kits comerciais: Testosterona (EIA-1559 DRG) e Testosterona (CLIA - 33560Beckman Coulter) em L. wiedii estimulados com análogo de GnRH (n=3) e análogo de hCG (n=2), a detecção de andrógenos fecais com o kit comercial Testosterona (EIA -1559 - DRG) em machos de L. pardalis (n = 2) e L. tigrinus (n=1) também estimulados com análogos de GnRH e a detecção de corticoides fecais pelo kit comercial Cortisol (EIA-1887 - DRG), em machos L. wiedii (n=2), L. pardalis (n=2) e L. tigrinus (n=2) estimulados com análogo de ACTH. Foi observado uma forte correlação (r=0,9299 e p<0,0001) entre os métodos EIA e CLIA. Os kits Testosterona EIA DRG-1559 e DRG Cortisol EIA-1887, respectivamente, foram eficazes na identificação de alterações dos metabólitos fecais de andrógenos e corticoides em L. wiedii, L. pardalis e L. tigrinus estimulados com GnRH e ACTH. Machos de L. wiedii (n=6) foram avaliados para eficiência reprodutiva em cativeiro pelo monitoramento de andrógenos fecais, exame clínico, coleta de sêmen por eletroejaculação (n=30) e pareamento com fêmeas (n=5). Todos os machos produziram sêmen, mas um animal foi azoospérmico em todas as amostras e outro animal foi azoospérmico na maioria das amostras (4/5). O sêmen de L. wiedii mostrou uma baixa taxa de espermatozoides móveis (8,44 ± 1,95 X 106sptz/ml) com altas taxas de defeitos espermáticos (46,29 ± 3,79 %). Foi gerado apenas um filhote. O período de pareamento com fêmeas não influenciou o nível de andrógenos fecais (p=0,995) ou a produção média de espermatozoides viáveis (p=0,469), antes e após o período. Palavras chaves: Androgenos, corticoides, felídeos, endocrinologia.

Abstract: Testing the efficiency of alternative technologies in reproduction programs were the objectives of this work in Ocelots (Leopardus pardalis), tigrinas (Leopardus tigrinus) and margays (Leopardus wiedii). Frozen semen has been used in genomic resource banking of endangered species.. Four L. pardalis were anesthetized on four to five different occasions with an interval of 30 days, totaling 17 procedures, with tiletamine-zolazepam hydrochloride (7 mg/kg) and xylazine (1 mg/kg) association. This combination of tiletamine-zolazepam and xylazine provided a good anesthesia quality of a short latency period, good viable anesthetic period and safety to proceed the electroejaculation in L. pardalis, with good quality of obtained semen. L. tigrinus (n=13), L. pardalis (n=4) and L. wiedii (n=6) were anesthetized and subjected to monthly collections of semen with three to five replications in each individual. Samples were evaluated and semen were tested for cryopreservation protocols with commercial diluents (Bioxcell®, in L. tigrinus; Andromed® in L. tigrinus, L. wiedii and L. pardalis; Test Yolk Buffer® in L. tigrinus, L. wiedii and L. pardalis) and two cryopreservation curves a) TK freezing curve in automated equipment (TK 3000®) with cooling rates - 0.25oC/min and freezing -20°C/min and b) GEL curve with cooling and stabilization in refrigerator 20°C to 5°C in two hours and freezing in a styrofoam box in 4 minutes in 8 cm and 3 cm above the nitrogen platforms, showing better results with TYB diluent associated TK curve in all experiments. In this work the ability to detect fecal androgens was tested by two different commercial kits: Testosterone (EIA-1559 DRG) method by enzymeimmunoassay (EIA) and 33560 Testosterone assay (Beckman Coulter) by chemiluminescence (CLIA) in L. wiedii stimulated with GnRH analog (n=3) and hCG analog (n=2), the detection of fecal androgens Testosterone commercial kit (EIA-1559 - DRG) in male L. pardalis (n=2) and L. tigrinus (n=1) stimulated with GnRH analogues and detection of fecal steroids by Cortisol commercial kit (EIA-1887 - DRG) by the method of enzymeimmunoassay (EIA) in male L. wiedii (n=2), L. pardalis (n=2) and L. tigrinus (n = 2) stimulated with ACTH analog. DRG (EIA) and Beckman Coulter (CLIA) with a strong correlation (r=0.9299 and p<0.0001) between methodologies. Testosterone EIA kits DRG-1559 and DRG Cortisol EIA-1887, respectively, were effective in identifying endocrine changes of fecal androgens and fecal steroids in L. wiedii, L. pardalis and L. tigrinus stimulated with GnRH and ACTH. Males of L. wiedii (n=6) were evaluated for reproductive efficiency in captivity, through fecal androgens monitoring, clinical examination, semen collection by electroejaculation (n=30), pairing with females (n=5). All males produced semen, but one animal was azoospermic in all collection procedures and other animal was azoospermic in most samples (4/5). The semen showed a low rate of mobile sperm (8.44 ± 1.95 X 106sptz/ml) with high morphological sperm defects (46.29 ± 3.79%). Five males and five females were paired for 70 days, generating only one puppy. The pairing with females did not influence the level of fecal androgens (p=0.995) or the average production of viable sperm (p=0.469) measured before and after the period. Key-woords: androgens, fecal steroids, felids, endocrinology.