Distribuição de códon 167 da isoforma 1 do gene da beta-tubulina em ciatostomíneos de equinos

Abstract

Resumo: Ciatostomíneos (Nematoda, Strongylida), conhecidos como pequenos estrôngilos, possuem ciclo de vida direto e são o grupo mais comum e patogênico de nematóides intestinais que infectam cavalos em todo o mundo. A presença de grande quantidade de vermes adultos pode provocar letargia, debilidade, diarreia e perda de peso no hospedeiro, porém a situação mais grave ocorre quando grande quantidade de larvas, no quarto estágio larval (L4), emerge simultaneamente da parede intestinal, provocando uma condição conhecida como ciatostomíase larval. Considerando os crescentes níveis de resistência anti-helmíntica, que tem tornado o controle da infecção por esses nematoides um grande desafio, o objetivo deste trabalho foi utilizar ensaios moleculares para detectar esses parasitos e fornecer um diagnóstico da resistência aos benzimidazóis (BZ) em um tempo reduzido, permitindo o monitoramento da eficácia dos anti-helmínticos e possíveis tomadas de decisões. Para isso, foram realizados testes moleculares, procedendo com a extração de DNA em parasitas adultos e de larvas de terceiro estágio (L3), reação em cadeia de polimerase (PCR), sequenciamento e análises de bioinformática. As larvas foram obtidas através de coprocultura de amostras de fezes de cavalos naturalmente infectados de três propriedades no Paraná, Santa Catarina e São Paulo. Os resultados da extração de DNA de ciatostomíneos adultos mostram que a técnica obteve boa quantidade de DNA, com boa qualidade, além de ser mais rápida e econômica que as relatadas. Os testes com L3 mostraram que a presença do alelo de resistência no códon 167 da beta-tubulina isotipo 1 está amplamente difundida nas propriedades, identificando 61,2; 38,5 e 31,5%, (média de 45%) de amostras heterozigotas resistentes (TTC/TAC) nos estados do Paraná, Santa Catarina e São Paulo, respectivamente. O monitoramento e a detecção da resistência são importantes ferramentas para um correto manejo do controle parasitário. Os dados com a árvore filogenética revelaram que larvas com ou sem a mutação ficaram agrupadas em áreas separadas, indicando claro mecanismo de seleção pelo fragmento estudado. A correlação entre o manejo e os resultados moleculares permitirá incrementar as abordagens sobre estratégias de diagnóstico e o controle dos ciatostomíneos em equinos. Palavras-chave: Equinos, Ciatostomíneos, Resistência anti-helmíntica, PCR.

Abstract: Cyathostomes (Nematoda, Strongylida) known as small strongyles, have a direct lifecycle and are presently considered the most common and pathogenic group of intestinal nematodes infecting horses worldwide. Large numbers of adult worms may cause clinical symptoms such as lethargy, debilitation, diarrhea and sudden weight loss in the host, but when a large number of larvae at the fourth larval stage (L4), emerge simultaneously from the intestinal wall, there is a condition known as larval cyathostominosis which can result in a high fatality rate. Considering the increasing levels of anthelmintic resistance, which has become the control of infection with these nematodes challenging, the objective was to meet the growing need for the use of molecular assays to detect these parasites and provide an accurate diagnosis of resistance to benzimidazole (BZ) in a short time, allowing monitoring of the effectiveness of anthelmintics and possible decision making. For this, molecular tests were performed, proceeding with DNA extraction from adult parasites and third stage larvae (L3), polymerase chain reaction (PCR) and sequencing, and bioinformatics analysis. L3 were obtained from fecal culture of stool samples from horses with naturally infections from 3 properties: in Parana, Santa Catarina and São Paulo. Adult extraction obtained good DNA quality, as well as being faster and more economically than those reported. The L3 tests showed that the presence of resistance allele at codon 167 of beta-tubulin isotype 1 is widespread in all the three properties. Were identified 61.2 ; 38.5 and 31.5% (average 45%) of heterozygous resistant samples (TTC/TAC) on the properties of Paraná, Santa Catarina and São Paulo states, respectively. The monitoring and detection of resistance are important tools for correct parasite control management, and this study showed important information that may assist in diagnosis and correct resistance management. The data in the phylogenetic tree showed that larvae with or without mutation were clustered into separate areas, indicating the obvious selection mechanism to the fragment studied. The correlation between management and the results from molecular approaches would improve the diagnostic and control of cyathostomins. Keywords: Horse, Cyathostomins, Anthelmintic resistance, PCR.