Análise de expressão dos ativadores de transcrição SyrM1, SyrM2, NodD1, NodD2 e Ttsl de Rhizobium sp. NGR234

Abstract

Resumo: Rhizobium sp. NGR234 é um microrganismo fixador de nitrogênio que estabelece uma relação simbiótica com plantas da família Fabaceae e induz a formação de nódulos radiculares onde ocorre a fixação de nitrogênio. Essa relação de simbiose é determinada e controlada por ambos os organismos simbiontes através da produção de moléculas sinalizadoras, o que depende de um controle fino de regulação da expressão gênica. O NGR234 possui capacidade de estabelecer uma relação simbiótica com 112 gêneros de legumes, o que o torna alvo de vários estudos na busca de se compreender quais os mecanismos envolvidos nesta promiscuidade simbiótica. Já se sabe que genes envolvidos com nodulação, secreção de proteínas através do sistema de secreção do tipo III e modificação de moléculas sinalizadoras (exopolissacarídeos, lipopolissacarídeos) da superfície celular são regulados, em NGR234, pelos ativadores transcricionais NodD1, NodD2, SyrM1, SyrM2 e TtsI. A função destes reguladores, exceto SyrM1, está bem estabelecida e permitiu a proposição de uma cascata regulatória. Entretanto a regulação da expressão dos genes codificadores destes reguladores ainda não está completamente estabelecida. Para analisar o perfil de expressão destes genes, as suas regiões promotoras foram clonadas a montante do gene que codifica para a proteína fluorescente verde (GFP) e as fusões transcricionais resultantes foram testadas em diferentes condições e estirpes. Os resultados obtidos mostram que a expressão de syrM1 é, aparentemente, constitutiva e seu produto, SyrM1, reprime a expressão de ttsI e nodD1, especialmente na ausência de flavonóides. A expressão do gene syrM2 é dependente de flavonóides e NodD1 e é reprimido pelo seu próprio produto. A ação de SyrM1 e SyrM2 deverão ser melhor investigadas, uma vez que agem potencialmente através da ligação à mesma seqüência regulatória, syrM-box. Ainda não se pode confirmar a ligação de SyrM1 ao syrM-box presente na região intergênica entre ttsI e nodD2. A presença de moléculas indutoras contaminantes durante os experimentos de expressão in vivo, utilizando gfp, compromete a análise precisa da regulação dos genes em estudo. Palavras-chave: NGR234. Reguladores transcricionais. Genes de nodulação.

Abstract: Rhizobium sp. NGR234 is a nitrogen fixing microrganism that develops a symbiotic relation with the Fabaceae plant family, providing them with nitrogen in the form of ammonium. This symbiotic relationship is settled and controled by both organisms through a gene expression regulation fine control. This microrganism is able to establish a symbiotic relationship with 112 vegetable genera, which makes it subject to several studies that aim to understand the mechanisms involved in this symbiotic promiscuity. It is known that genes involved with nodulation, protein secretion through the type 3 secretion system and modification of cellular surface signaling molecules (exopolysaccharides and lipopolysaccharides) are regulated, in NGR234, by transctiptional activators NodD1, NodD2, SyrM1, SyrM2 and Ttsl. The function of these regulators is well established, except for SyrM1, and allowed the proposition of a regulatory cascade. The expression regulation of these activators has been studied but is not completely elucidated. Thus, it is aimed to contribute to the disclosure of the regulatory cascade that controls the nodulation and secretion of proteins through the type III secretion system (T3SS) in Rhizobium sp. NGR234. In order to do so, these genes promoter regions were cloned flanking the gene that codes for green fluroescent protein. These transcriptional fusions were tested in different conditions and strains to evaluate their regulation. syrM1 expression is apparently constitutive and its product, SyrM1, inhibits the expression of ttsl and nodD1, especially in the absence of flavonoids. Gene syrM2 expression is NodD1 and flavonoid-dependent and is inhibited by its own product. SyrM1 and SyrM2 functions shall be better investigated, since they bind potentially to the same regulatory sequence, SyrM-box. A double mutant of these two genes has not yet been obtained, neither the binding of SyrM1 to the syrM-box present in the intergenic region betwen ttsl and nodD2 confirmed. Contaminat inducer molecules during in vivo gene expression experiments, using gfp, compromises the precise analysis of the regulation of the genes been studied. Keywords: NGR234. Trancriptional regulators. Nodulation genes.