Análise proteômica de bactérias simbióticas fixadoras de nitrogênio de interesse agronômico

Abstract

Resumo: A fixação biológica do nitrogênio (FBN) desempenha um papel fundamental na incorporação do nitrogênio na biosfera, principalmente através da simbiose entre bactérias fixadoras de nitrogênio, comumente denominadas de rizóbios, e plantas leguminosas. Na agricultura, a utilização de bactérias competitivas, tolerantes a condições de estresse e eficientes na fixação do nitrogênio tem promovido redução de custos, aumento da produtividade e benefícios ao meio ambiente, características que fizeram da FBN um dos pilares da sustentabilidade agrícola. Neste contexto, identificar os fatores que conferem tais qualidades a determinadas estirpes de rizóbios é necessário para o melhor entendimento e o aproveitamento do processo simbiótico de fixação do nitrogênio. Com esse objetivo, duas estirpes com elevada eficiência em fixar nitrogênio e capazes de tolerar estresses comuns a regiões tropicais, como altas temperaturas, Rhizobium freirei PRF 81 e Bradyrhizobium diazoefficiens CPAC 7, foram caracterizadas com o auxílio de ferramentas da genômica funcional. R. freirei é simbionte do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) e B. diazoefficiens da soja (Glycine max (L.) Merr). Através da eletroforese bidimensional (2-DE) seguida da espectrometria de massas foram obtidos os mapas proteômicos, identificando, para cada estirpe, 115 proteínas. Nos dois estudos, as proteínas relacionadas com as atividades metabólicas foram as mais numerosas, refletindo diretamente na elevada competitividade apresentada por essas estirpes. Proteínas importantes para o estabelecimento da simbiose e relacionadas à tolerância a condições de estresse, sobretudo as mais comumente encontradas em regiões tropicais, também foram evidenciadas. Diversas proteínas hipotéticas identificadas no mapa proteômico da estirpe CPAC 7 tiveram suas prováveis funções atribuídas por meio de ferramentas de bioinformática. Outras, com pouca ou nenhuma informação disponível, tiveram a expressão de seus respectivos genes avaliada por PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR) na presença do flavonoide genisteína, um composto liberado pelas raízes das plantas hospedeiras capaz de induzir o estabelecimento da simbiose. Entre os genes analisados, seis apresentaram indução significativa, incluindo o gene para a proteína Blr0227 de B. diazoefficiens, que participa da biossíntese de poli-beta-hidroxibutirato (PHB), um composto que pode estar relacionado com a elevada competitividade apresentada por essa estirpe. Os resultados alcançados com a combinação da análise proteômica, bioinformática e o estudo da expressão de genes para proteínas hipotéticas geraram novas informações sobre as propriedades dos microssimbiontes estudados. Palavras-chave: Rhizobium freirei, Bradyrhizobium diazoefficiens, proteômica, RT-qPCR, estresses ambientais, proteínas hipotéticas.

Abstract: Biological nitrogen fixation (BNF) has an outstanding role in the nitrogen incorporation on the biosphere, mainly by the symbiosis between N2-fixing bacteria, which are frequently referred to as rhizobia, and leguminous plants. In agriculture, the use of bacteria highly competitive, tolerant to stressful conditions and efficient in nitrogen fixation contributes to the improvement of food production, to decrease the input costs and to mitigate environmental degradation, features that include BNF as one of the pillars of the sustentability. In this sense, highlighting the factors that confer such qualities to rhizobial strains is required to better understand and maximize the nitrogen fixation process. With this aim, two strains efficient in fixing nitrogen and tolerant to different stressing conditions, Rhizobium freirei PRF 81 and Bradyrhizobium diazoefficiens CPAC 7, were studied by functional genomic tools. R. freirei is a symbiont of common bean (Phaseolus vulgaris L.) and B. diazoefficiens of soybean (Glycine max (L.) Merr.). The proteomic reference maps were obtained by two-dimensional electrophoresis (2-DE) and mass spectrometry, and allowed the identification, for each strain, of 115 proteins. In both strains, proteins related to the metabolism were the most abundant, reflecting the metabolic plasticity showed by these strains. Important determinants to the symbiosis establishment and to the tolerance of adverse conditions, especially those experienced in tropical regions, were also detected. Several hypothetical proteins identified in the CPAC 7 proteomic map had their putative functions attributed by the use of bioinformatics tools. Others, with few or without available information, had their coding-genes analysed by real time quantitative PCR (RT-qPCR) in response to one nodulation-inducing molecule, the flavonoid genistein. Among these genes, six were significantly up-regulated, including the protein codding-gene blr0227 that is envolvet with poly-beta-hydroxybutirate (PHB) biosynthesis, which might be related to the bacteria competitiveness. The results obtained by the combination of proteomics analysis, bioinformatics and gene-expression assays resulted in new information about the microssymbionts properties. Keywords: Rhizobium freirei, Bradyrhizobium diazoefficiens, proteomics, RTqPCR, environmental stress, hypothetical proteins.