Sulfatação química do polissacarídeo de goma de exsudato de Vochysia thyrsoidea e avaliação das atividades anticoagulante e antitrombótica

Abstract

Resumo: A heparina é um glicosaminoglicano altamente sulfatado que tem grande importância clínica como agente anticoagulante e antitrombótico, principalmente, por se ligar à antitrombina (AT) e ao cofator II da heparina (HCII), acelerando a taxa com que estes inibidores de serino proteases inativam enzimas da coagulação, como a !- trombina e o fator Xa. Embora eficaz, a heparina pode causar, entre outros efeitos adversos, sangramento e trombocitopenia, além de ser obtida a partir do intestino suíno e pulmão bovino, gerando grande preocupação com contaminação por patógenos animais. Na busca por agentes anticoagulantes e antitrombóticos alternativos à heparina e de origem não animal, uma glicoglucuronomanana extraída da goma de exsudato de Vochysia thyrsoidea (VTh; MW = 92.500 g/mol) foi hidrolisada (Ph-VTh; MW = 58.250 g/mol) e quimicamente sulfatada (VThS e Ph- VThS). O grau de substituição por grupos sulfato (DS) foi determinado para VThS (0,20) e Ph-VThS (0,24). Esses baixos valores de DS resultaram em pouca diferença nos espectros de RMN dos polissacarídeos antes e após a sulfatação. A análise de metilação indicou que a sulfatação ocorreu, preferencialmente, na posição O-5 de unidades de arabinose no polissacarídeo nativo, e na posição O-6 de unidades de manose no polissacarídeo hidrolisado. Teste de aPTT mostrou que os polissacarídeos sulfatados apresentam atividade anticoagulante (8,59 UI/mg - VThS e 2,67 UI/mg - Ph-VThS), e que esta atividade pode ser inibida por protamina. Na avaliação do mecanismo de anticoagulação, VThS e Ph-VThS mostraram uma resposta do tipo serpino-dependente, conseguindo inibir a !-trombina e o fator Xa apenas na presença de AT e HCII. No modelo in vivo de trombose venosa, VThS e Ph-VThS reduziram a formação do trombo em aproximadamente 50%, na dose de 40 UI/kg, alcançando resultados estatisticamente similares aos da heparina em todas as concentrações testadas. A administração dos polissacarídeos em ratos por via subcutânea, seguida de avaliação do aPTT 2 e 3 VTh após, mostrou que Ph- VThS é absorvido por esta via e que o efeito anticoagulante diminuiu da segunda para a terceira hora, sugerindo sua biodegradação e/ou excreção. Os resultados obtidos demonstram que os polissacarídeos obtidos a partir da goma de exsudato de V. thyrsoidea, quando sulfatados, são promissores agentes anticoagulantes e antitrombóticos. Palavras chave: Glicoglucuronogmanana, sulfatação química, atividade anticoagulante, atividade antitrombótica.

Abstract: Heparin is a highly sulfated glycosaminoglycan that has great clinical importance as an anticoagulant and antithrombotic agent, mainly by binding to antithrombin (AT) and heparin cofactor II (HCII), accelerating the rate at which these inhibitors of serine proteases inactivate enzymes of the coagulation cascade, such as !-thrombin and factor Xa. Although effective, heparin can cause, among other adverse effects, bleeding and thrombocytopenia, as well as being obtained from bovine lungs and porcine intestines, generating great concern about contamination with animal pathogens. In the search for anticoagulant and antithrombotic agents from a nonanimal source, as alternatives to heparin, a glycoglucuronomannan from the gum exudate of Vochysia thyrsoidea (VTh; MW = 92,500 g/mol) was hydrolyzed (Ph-VTh; MW = 58,250 g/mol) and chemically sulfated (VThS and Ph-VThS). The degree of substitution (DS) was determined for VThS (0.20) and Ph-VThS (0.24). These low DS values resulted in little differences in the NMR spectra of the polysaccharides before and after sulfation. Methylation analysis indicated that sulfation occurred preferentially at the O-5 position of arabinose units in the native polysaccharide, and at the O-6 position of mannose units in the hydrolyzed polysaccharide. aPTT test showed that sulfated polysaccharides have anticoagulant activity (8.59 IU/mg - VThS and 2.67 IU/mg - Ph-VThS), and this activity can be inhibited by protamine. In the evaluation of anticoagulation mechanism, VThS and Ph-VThS showed a serpindependent response, inhibiting !-thrombin and factor Xa only in the presence of AT and HCII. In in vivo model of venous thrombosis, VThS and Ph-VThS reduced thrombus formation approximately 50% at a dose of 40 IU/kg, reaching statistically similar results to heparin in all concentrations tested. The administration of the polysaccharides in rats by subcutaneous route, followed by aPTT evaluation 2 and 3 hours later, showed that Ph-VThS is absorbed by this route and that the anticoagulant effect decreased from the second to the third hour, suggesting their degradation and/or excretion. The results showed that polysaccharides obtained from the gum exudate of V. thyrsoidea, when sulfated, are promising anticoagulant and antithrombotic agents. Keywords: Glycoglucuronomannan, chemical sulfation, anticoagulant activity, antithrombotic activity.