Detecção e identificação de Cryptosporidium spp. Tyzzer, 1907 em fezes de animais e em água do Zoológico Municipal de Curitiba, Paraná, Brasil

Abstract

Resumo: O protozoário Cryptosporidium pertence ao filo Apicomplexa. Possui capacidade de infectar todas as classes de vertebrados (aquáticos, aéreos, terrestres), inclusive o ser humano. Atualmente, são reconhecidas vinte e uma espécies de Cryptosporidium e aproximadamente 40 genótipos foram identificados. A infecção ocorre por meio da ingestão de oocistos liberados infectantes nas fezes dos hospedeiros. Algumas espécies apresentam potencial zoonótico, como C. parvum e C. meleagridis. Cryptosporidium causa diarreia, normalmente com cura espontânea, sendo mais grave em indivíduos imunodeprimidos ou portadores de doenças autoimunes. As coleções de água potável e de recreação são as principais fontes de infecção. Em países desenvolvidos faz-se o monitoramento da água, para consumo, distribuída à população, porém naqueles em desenvolvimento o mesmo não ocorre e a doença é considerada negligenciada. No mundo poucos trabalhos são encontrados tratando da prevalência e dinâmica da transmissão da criptosporidiose em zoológicos, os quais apresentam singularidades que facilitam este tipo de estudo, apesar do fato de os animais não estarem em seus habitats naturais. No Brasil, não existem estudos em zoológicos contemplando a detecção de Cryptosporidium em fezes de animais e nas águas dos lagos presentes nestes ambientes. O objetivo do presente trabalho foi verificar a presença de Cryptosporidium em fezes de aves e mamíferos e nas águas dos recintos e lagos do Zoológico Municipal de Curitiba. No período de março/2011 a dezembro/2011, 249 amostras fecais (121 de aves e 128 de mamíferos) foram coletadas e processadas para detecção, identificação morfológica e molecular. As fezes foram filtradas, sedimentadas e submetidas ao protocolo de purificação em solução saturada de NaCl. O material foi analisado por meio da técnica de Ziehl-Neelsen modificada e processado para extração de DNA e detecção por PCR e Nested PCR. Amostras de seis coleções aquáticas (três em cada coleção, N=18) também foram coletadas para análise. A água foi filtrada em membrana de acetato-celulose e o eluato obtido foi processado para a realização da técnica de coloração de Ziehl-Neelsen modificada, e detecção molecular do parasito por PCR e nested PCR, usando iniciadores para a região hiper-variada do gene 18SSU rDNA. Das amostras fecais analisadas, duas foram positivas para a coloração de Ziehl-Neelsen modificada sendo uma de ararajuba (Guaruba guarouba) e outra de papapagaio-de-cara-roxa (Amazona brasiliensis). A Nested PCR foi positiva nas duas amostras anteriores e em uma terceira, proveniente de outro papagaio-da-cara-roxa. O material de um quarto animal, um papagaio-de-peito-roxo (Amazona vinacea), também foi positivo na PCR de primeira etapa. Das coleções aquáticas amostradas uma apresentou positividade em duas das três amostras coletadas. O registro de Cryptosporidium nestas aves é o primeiro na literatura mundial. Os isolados obtidos foram sequenciados. A espécie C. galli foi identificada nas amostras provenientes de aves e C. parvum nas amostras provenientes de coleções aquáticas e para o controle de referência. Uma árvore filogenética utilizando análise Bayesiana foi construída e nela os isolados identificados ficaram em um mesmo ramo, com um bom suporte, já o controle ficou no mesmo grupo da sequência de C. parvum do GenBank. Estes resultados indicam similaridade dos isolados encontrados. Conclui-se que o presente trabalho poderá servir como subsídio para a ambientação dos recintos e para o manejo dos animais, principalmente no que se refere ao contato com as águas do ambiente para a saúde dos animais, dos trabalhadores e visitantes do zoológico, devido à identificação de uma espécie de potencial zoonótico C. parvum. Palavras-chave: Zoonoses; Saúde Pública; Animais Silvestres; protozoários.

Abstract: The Cryptosporidium protozoan belongs to the phylum Apicomplexa. It is capable of infecting all vertebrate classes (aquatic, aerial, and terrestrial), including humans. Currently, twenty one species of the genus Cryptosporidium are recognized, and approximately 40 genotypes were identified. Infection occurs through the ingestion of infected oocysts released in the feces of the hosts. Some species have zoonotic potential, such as C. parvum and C. meleagridis. Cryptosporidium causes diarrhea, usually with spontaneous cure, being more worrisome in immunocompromised individuals or patients with autoimmune diseases. The collections of drinking water and recreation are the main sources of infection. In developed countries the drinking water supplied to the population is monitored for this pathogen, however the same does not occur in developing countries where the disease is considered neglected. In the world few studies dealing with the prevalence and transmission dynamics of cryptosporidiosis in zoos are found. These spaces have singularities that facilitate this type of study, despite the fact that animals are not in their natural habitats. In Brazil, there are no studies in these environments contemplating cryptosporidiosis. This work aims to verify Cryptosporidium infection in captive birds and mammals, and also in the water bodies and pounds in the enclosures of the Municipal Zoo of Curitiba. From March 2011 to December 2011, 249 fecal samples, 121 birds and 128 mammals were collected and processed for morphological and molecular identification of Cryptosporidium. Feces were filtered, pelleted and subjected to the purification protocol in saturated NaCl solution. Samples were analyzed following Ziehl-Neelsen modified technique, and processed for DNA extraction and detection by PCR and Nested PCR. Water samples from six sites (three in each site, N=18) were also collected for analysis. The water was filtered through a cellulose-acetate membrane and the eluate obtained was processed by Ziehl-Neelsen modified technique, followed by the molecular detection through PCR and Nested PCR, using primers for the hyper-diverse region of the rDNA gene 18SSU. Two fecal samples were positive on microscopy for Cryptosporidium: one from Golden Parakeet (Guaruba guarouba) and other from Red-tailed Amazon (Amazona brasiliensis). The Nested PCR was positive for the two previous samples and also in a third from another Red-tailed Amazon. The material of a fourth animal, Vinaceous Amazon (Amazona vinacea), was also positive in PCR first step. For the water collection, one was positive in two of the three samples. The record of Cryptosporidium in these birds is the first in the world literature. The isolates obtained were sequenced. The species C. galli was identified for isolates from birds and C. parvum isolate derived for the collection of water and the control reference. A phylogenetic tree was constructed using Bayesian analysis, where the isolates identified in this study clustered in the same branch, with good support, since the control group was the same sequence of C. parvum from GenBank. These results indicate similarity of isolates found. We conclude that this study can serve as input to the ambiance of the grounds and for the handling of animals, especially with regard to contact with the waters of the environment for the animals' health, workers and visitors to the zoo, due to identifying a kind of C. parvum zoonotic potential. Keywords: Zoonoses, Public Health; Wild Animals; Protozoa.