Mutagenese sítio dirigida do domínio n-terminal da proteína Nifa de Herbaspirillum seropedicae

Abstract

Resumo : Herbaspirillum seropedicae é um organismo fixador de nitrogênio (diazotrófico) que possui potencial aplicação como fertilizante biológico. A regulação da expressão dos genes que codificam proteínas/enzimas envolvidas na fixação de nitrogênio, genes nif, é dependente do controle da expressão e atividade da proteína NifA. Nos diazotrofos, esta proteína atua como ativador transcricional de promotores genes nif (JN dependentes. A proteína NifA apresenta três domínios estruturais: o domínio C-terminai com um motivo héiice-voita-héiice altamente conservado e responsável pela ligação ao DNA; o dominio Central com um motivo de ligação de ATP e envo~vido na interação com a subunidade sigma da RNA polimerase e na formação o complexo aberto; e o domínio N-terminal, que apresenta o menor grau de similaridade entre as proteínas NifA e está envolvido no controle da atividade por nitrogênio fixado. A atividade da NifA em H. seropedicae é controlada por amônia e oxigênio. O controle por amônia está relacionado ao domínio N-terminal, uma vez que a proteína sem este domínio é ativa na ausência de oxigênio, independente dos níveis de amônia. Para ampliar a compreensão, a nível molecular, do mecanismo de controle por amônia do domínio N-termina!, aiguns aminoácidos foram substituídos através de mutagênese sítio-dirigida deste domínio. Após a comparação da seqüência de aminoácidos da NifA de Azospirillum brasilense, Rhodobacter capsulatus e H. seropedicae, os resíduos de valina nas posições 40 e 138 foram escolhidos para substituição por ácido giutâmico. A seqüência de nucieotídeos do domínio Nterminal da NifA selvagem de H. seropedicae foi clonada no vetor de expressão pET28a, originando o plasmideo pLET. Este plasmídeo foi utilizado como DNA molde nas amplificações do domínio N-etrminal da NifA e será utilizado como controle das mutagêneses sítio-dirigida e dos posteriores testes fisiológicos. O estudo dos efeitos das mutações sítio-dirigidas contribuirá para a melhor compreensão do mecanismo de controie do domínio N-terminal da NifA de H. seropedicae pelo nitrogênio.