Análise estrutural das proteínas PHBF, PHAP1 e HFQ de Herbaspirillum Seropedicae

Abstract

Resumo: Herbaspirillum seropedicae SmR1 é uma ?-proteobactéria capaz de colonizar de forma endofítica diversas plantas de interesse comercial, sugerindo o seu uso como um potencial biofertilizante. Este trabalho é apresentado em dois blocos que descrevem a caracterização de proteínas de H. seropedicae SmR1 envolvidas no metabolismo do polímero polihidroxibutirato (PHB) e na regulação pós-transcricional da expressão gênica, com o objetivo de explorar os mecanismos regulatórios destas proteínas do ponto de vista molecular e estrutural. O capítulo 1 descreve a caracterização das proteínas PhbF e PhaP1 envolvidas no metabolismo de PHB. A capacidade de produzir este poliéster alifático é um importante fator associado à sobrevivência no ambiente em condições de estresse e competitividade com outras bactérias. Este polímero é estocado no interior das células na forma de grânulos cobertos por uma camada de várias classes de proteínas que regulam desde a produção/degradação do polímero, passando por seu tamanho e chegando a transcrição. PhbF está relacionada com a regulação transcricional e PhaP1 ou fasina está envolvida na regulação da relação volume/superfície dos grânulos. Estas proteínas foram expressas de forma heteróloga em Escherichia coli e purificadas com sucesso na forma fusionada a uma cauda de histidinas, utilizando o detergente TritonX-100. Experimentos de gel filtração revelaram PhbF como uma proteína tetramérica e PhaP1 como uma proteína pentamérica, ambas em solução. A proteína PhbF foi capaz de ligar-se a onze prováveis regiões promotoras de genes envolvidos com o metabolismo de PHB em H. seropedicae, confirmando a sua atividade de ligação ao DNA. A análise in silico destas regiões promotoras indicou a sequência consenso 5'-TG[N]TGC[N]3GCAA-3' que foi protegida da ação da DNaseI na região promotora de phbF. Esta proteína foi também capaz de ligar-se ao polímero PHB extraído de H. seropedicae assim como PhaP1. A fasina interagiu fortemente com o PHB e foi capaz de aderir a um filme deste polímero onde foram observadas várias estruturas proteicas individualizadas com dimensão lateral média de 177,8 ± 11,7 Å. Esta dimensão é compatível com a distância máxima de 200 Å calculada para PhaP1 em solução pelo método de SAXS. Esta técnica permitiu também acessar o envelope molecular das proteínas PhbF e PhaP1. Aspectos in vivo relacionados à correlação entre o metabolismo de PHB e a transcrição dos genesphbF e phaP1 foram abordados através de fusões transcricionais ao gene lacZ. PhbF foi capaz de reprimir a sua própria expressão e a do gene phaP1 em E. coli sem a interferência do polímero PHB. Em H. seropedicae, foi possível observar o acoplamento entre a expressão dos genes phbF e phaP1 ao metabolismo de PHB assim como a mobilidade da proteína PhbF entre as formas ligada ao DNA e ligada ao grânulo de PHB. O capítulo 2 descreve a caracterização da chaperona de RNA Hfq de H. seropedicae. Esta é uma proteína homohexamérica, identificada em E. coli como um fator do hospedeiro envolvido na replicação do bacteriófago Q? e como um importante regulador pós-transcricional de vários tipos de RNA afetando uma série de funções bacterianas. A estrutura da proteína Hfq foi determinada por cristalografia de raios-X e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). A estrutura cristalográfica revelou uma topologia do tipo Sm conservada, composta por uma ?-hélice N-terminal seguida de cinco fitas ?, e uma nova interação intra-subunidades do tipo empilhamento ?-? entre dois resíduos de histidinas ausente em outras Hfqs com estrutura resolvida. Além disso, o envelope molecular calculado com base nos dados de SAXS concordou com a estrutura cristalográfica, sugerindo que a proteína tem a mesma

Abstract: Herbaspirillum seropedicae SmR1 is an endophitic ?-proteobacterium able to colonize several economically important crops, suggesting its potential use as a biofertilizer. This work is presented in two blocks describing the characterization of proteins related to polyhydroxybutyrate (PHB) metabolism and post-transcriptional regulation in H. seropedicae with the aim to explore the protein regulatory mechanisms at molecular and structural points of view. The chapter 1 describes the characterization of PhbF and PhaP1 proteins related to PHB metabolism. The ability to produce this polyester is an important factor associated with survival under stress conditions and in competitive environments. This polymer is storaged intracellularly as granules wich are covered by several proteins involved in granule synthesis/degradation, size and transcription regulation. PhbF is a transcriptional regulatory protein and PhaP1 or phasin regulates the granule volume/surface ratio. These proteins were expressed in Escherichia coli and purified using the detergent Triton-X100. The gel filtration assay described PhbF as a tetramer and PhaP1 as a pentamer in solution. PhbF was able to bind to eleven putative promoters of genes involved in PHA metabolism in H. seropedicae confirming its DNA binding property. In silico analysis indicated the consensus sequence 5'-TG[N]TGC[N]3GCAA-3' which was protected in DNA footprinting assay using phbF promoter region. This protein and PhaP1 were able to bind to PHB polymer extract from H. seropedicae. PhaP1 was also able to bind to PHB film as several structures with lateral dimension of 177.8 ± 11.7 Å compatible with Dmáx of 200 Å from SAXS mensurements. This approach also described the PhbF and PhaP1 molecular envelopes. In vivo aspects concern PHB metabolism and phbF/phaP1 transcription were approached by lacZ transcriptional fusions. PhbF was able to repress phaP1 expression as well as its own in E. coli. This system allowed the study of phbF and phaP1 without PHB metabolism interference. The H. seropedicae environment allowed to show that phbF and phaP1 expression are coupled to PHB metabolism and the PhbF mobility between DNA and PHB binding states. The chapter 2 describes the RNA chaperone Hfq from H. seropedicae. This protein is a homohexamer identified in E. coli as a host factor involved in phage Q? replication and also as an important post-transcriptional regulator of several types of RNA, affecting a plethora of bacterial functions. The Hfq protein structure was determined by X-ray crystallography and small angle X-ray scattering (SAXS). The crystal structure revealed a conserved Sm topology, composed of one N-terminal ?-helix followed by five twisted ?-strands, and a novel ?-? stacking intra-subunit interaction of two histidine residues, absent in other Hfq proteins. Moreover, the calculated envelope based on SAXS data agreed with the Hfq crystal structure, suggesting that the protein has the same folding structure in solution.