Produção, identificação e caracterização molecular de lacases de Agaricus blazei obtidas por fermentação de resíduos agroindustriais

Abstract

Resumo: Lacases são multicobre oxidases que reduzem oxigênio a água ao mesmo tempo em que oxidam um substrato do tipo p-diidroxi fenol ou outro composto fenólico. São enzimas comuns a vários organismos, mas a maior parte foi isolada de fungos. Sua baixa especificidade a substratos torna a lacase uma enzima com potencial para aplicação em diversos processos industriais. Sua síntese e secreção são influenciadas pelos níveis de nutrientes, condições de cultivo e pela adição de compostos fenólicos ou aromáticos que atuam como indutores da atividade. O uso de resíduos agroindustriais para produção de lacases permite o desenvolvimento de bioprocessos empregando-se substratos alternativos e de baixo custo, bem como a redução da degradação ambiental causada pelo descarte desses resíduos. Os objetivos desse trabalho foram produzir lacases de Agaricus blazei por fermentação submersa utilizando resíduos agroindustriais como fontes alternativas de carbono, identificar, sequenciar e analisar genes de lacase dessa espécie. Para tanto cinco cepas pertencentes à coleção de culturas do Laboratório de Biologia Molecular da Universidade Paranaense (UNIPAR) foram avaliadas. As cepas estudadas foram identificadas molecularmente como Agaricus blazei (U2/1, U2/2, U2/3 e U2/4) e Pleurotus ostreatus (U9/1). A produção de lacase sob diferentes concentrações da fonte nitrogênio e de CuSO4 foi estudada. Seis possíveis indutores foram analisados com o intuito de verificar o seu efeito sobre a atividade enzimática das cinco cepas. A produção de lacase em meio com ureia (6,0 g/L) e CuSO4 (150 M) ao final de 21 dias atingiu 13,7 U mL-1 por A. blazei (U2/4) e 14,2 U mL-1 por P. ostreatus (U9/1). Dentre as cepas avaliadas e todas as condições testadas, as maiores atividades induzidas de lacase foram verificadas para A. blazei U2/4 (8,4 U mL-1 com etanol e 8,5 U/mL com guaiacol) e P. ostreatus U9/1 (15 U mL-1 com etanol). Foram realizadas uma série de otimizações para a produção de lacase por fermentação submersa (FSm) utilizando como substratos resíduos agroindustriais com Agaricus blazei U2/4. O potencial dessa linhagem na produção de lacase por fermentação no estado sólido (FES) também foi estudado. A melhor fonte alternativa de carbono para produção de lacase em FSm foi o mel de cana. Após otimização das condições físico-químicas, verificou-se que o pico de atividade de lacase (9711 U L-1) foi obtido em meio composto por mel de cana (6 g L-1), ureia (1,5 g L-1), CuSO4 (150 M), MgSO4 (12 mM), etanol (1,2 mM), a 28ºC e pH 8,0 em 10 dias de cultivo. Em FES a maior atividade (284 U g-1 na base seca) foi obtida após 7 dias com bagaço de cana suplementado com solução nutritiva contendo ureia (6,0 g L-1) e CuSO4 (150 M), pH 8,0 e temperatura de 28ºC. Primers universais foram utilizados para identificar genes de lacase de Agaricus blazei (U2/1, U2/2, U2/3 e U2/4) e Pleurotus ostreatus (U9/1) por PCR. A digestão dos amplicons com endonucleases de restrição confirmou que os mesmos correspondiam a mais de um gene. A análise da sequência dos amplicons revelou a presença de sequências consenso típicas de promotores (TATABox e CAATBox) e a presença de elementos relacionados à regulação da expressão gênica, como elementos sensíveis a xenobióticos e elementos de resposta ao stress. As sequências de aminoácidos deduzidas mostraram elevada similaridade dos genes estudados com outras lacases fúngicas e apresentaram ao menos um domínio conservado pertencente à família das cobre oxidases.

Abstract: Laccase is a copper-containing polyphenol oxidase that uses the redox capacity of copper ions to catalyze the oxidation of a wide range of phenolic substrates while reduces molecular oxygen to water. It is a common enzyme and has been found in diverse groups of organisms, especially occurring in fungi. Their wide substrate specificity makes them able to oxidize a broad range of compounds, with potential for application in various industrial processes. Its synthesis and secretion are influenced by the levels of nutrients, growth conditions and by the addition of phenolic or aromatic hydrocarbons which act as inducers of the activity. The use of agroindustrial residues for laccase production allows the development of bioprocesses with alternative and low cost substrates and helps solving pollution problems, which otherwise their disposal may cause. The objectives of this research were to produce laccases from Agaricus blazei by submerged fermentation with agro-industrial residues and to identify, sequence and analyze laccase coding genes. Five fungal strains from Universidade Paranaense (UNIPAR) were evaluated. The strains were molecularly identified as Agaricus blazei (U2/1, U2/2, U2/3 e U2/4) and Pleurotus ostreatus (U9/1). The laccase production with different concentrations of nitrogen source and CuSO4 was analyzed. Six putative inducers of laccase activity were tested with the five strains. The laccase production with urea (6.0 g/L) and CuSO4 (150 M) in 21 days was 13.7 U mL-1 for A. blazei (U2/4) and 14.2 U mL-1 for P. ostreatus (U9/1). Laccase activity of A. blazei U2/4 was induced by ethanol (8.4 U mL-1) and guaiacol (8.5 U mL-1) and that of P. ostreatus U9/1 was induced by ethanol (15 U mL-1). A series of optimizations was carried out for the production of laccase by submerged fermentation (SmF) with agro-industrial residues and Agaricus blazei U2/4. The potential of this strain to produce laccase by solid state fermentation (SSF) was also evaluated. The best alternative carbon source for laccase production was sugarcane molasses. After optimization, it was found that the highest laccase activity (9,711 U L-1) was obtained in a medium containing sugarcane molasses (6 g L-1), urea (1.5 g L-1), CuSO4 (150 M), MgSO4 (12 mM), ethanol (1.2 mM), at 28ºC and pH 8.0 after 10 days. The highest laccase activity in SSF (284 U g-1) was obtained after 7 days with sugarcane bagasse supplemented with nutrient solution containing urea (6.0 g L-1) and CuSO4 (150 M), pH 8.0, and 28ºC. Universal primers were used to identify laccase genes from Agaricus blazei (U2/1, U2/2, U2/3 e U2/4) and Pleurotus ostreatus (U9/1) by PCR. The digestion of the amplicons with restriction endonucleases confirmed that they corresponded to more than one gene. The sequence analysis revealed the presence of promoter's consensus sequences (TATABox and CAATBox) and the presence of elements related to the gene expression regulation, as xenobiotic responsive elements and stress responsive elements. The deduced amino acid sequences showed strong similarity to other fungal laccases genes studied and had at least one conserved domain belonging to the family of copper oxidases.