Clonagem e expressao do gene GinB de Azospirillum brasilense

Abstract

Resumo : Azospirillum brasilense é um microrganismo, diazotrofo, endofítico facultativo, encontrado em associação com inúmeras plantas de importância agrícola. O processo de fixação do nitrogênio envolve um alto gasto energético, sendo altamente regulado tanto a nível da síntese do complexo enzimático nitrogenase, quanto a nível de sua atividade. A proteína PII (GinS), produto do gene glnB, é uma das proteínas envolvidas na cascata de regulação da fixação de nitrogênio. Esta proteína é responsável pelo sensoriamento dos níveis de nitrogênio intracelular. O gene glnB de Azospirillum brasilense foi clonado a partir da amplificação por peR utilizando como molde o DNA genômico deste organismo e oligonucleotídeos sintetizados quimicamente. A seqüência de bases desses oligonucleotídeos foi baseada naquela depositada no banco de dados GENSANK. O fragmento amplificado de 369 pb foi clonado e sequenciado nos vetores de expressão pET28a e pT7-7 entre os sítios Ndel e BamHI e no vetor pTZ19R entre os sítios Xbal e Hindlll, originando os plasmídeos pLMA-MLV1 pLMA-4 e pLMA-2, respectivamente. Após crescimento e indução com IPTG ou lactose, a proteína PII foi superexpressa. O plasmídeo pLMA-MLV1 expressou a proteína PII como uma fusão a uma sequência contendo 6 histidinas (His-Tag) enquanto o plasmídeo pLMA-4 expressou a proteína PII nativa. A taxa de migração das proteínas em gel de poliacrilamida-SDS foi do tamanho esperado, 15 kDa para a proteína PII-His e 13 kDa para a proteína PII nativa. Ambas as proteínas, PII nativa e PII-His, foram superexpressas e encontradas solúveis.