Clonagem do gene hrq1 e expressão, purificação e cristalização da proteína Hrq1 de Saccharomyces cerevisiae, uma RecQ4 homóloga

Abstract

Resumo : Helicases são enzimas necessárias para a abertura da dupla fita de ácidos nucleicos para replicação e reparo. As helicases da família RecQ são consideradas as guardiãs do genoma (Hickson et. al. 2003). Mutações em três genes de proteínas RecQ em humanos estão associadas com síndromes que tem como característica geral predisposição a vários tipos de câncer. São elas a Síndrome de Bloom (envolvido com mutações na helicase BLM), Síndrome de Werner (mutações na helicase WRN) e Síndrome de Rothmund-Thomson (envolvido com mutações na helicase RecQ4). As helicases BLM e WRN são bem estudadas enquanto que RecQ4 e seu papel na síndrome de Rothmund-Thompson permanece desconhecido. Em seres humanos há outra duas proteínas da família RecQ, RecQ5 e RecQ1, que não estão associadas a síndromes. Saccharomyces cerevisiae era conhecido por possuir apenas uma proteína da família RecQ, a helicase Sgs1. Entretanto, Barea et. al. (2008) propuseram a existência de uma segunda proteína da família RecQ, chamada Hrq1, que seria ortóloga à proteína RecQ4 em humanos. Tendo em vista as dificuldades de trabalho encontradas com a proteína RecQ4 pela baixa solubilidade e alto nível de proteólise, a proteína Hrq1 apresenta-se como uma boa alternativa para a elucidação das funções de RecQ4 na síndrome de Rothmund-Thompson. Portanto, este trabalho tem como objetivo estabelecer um protocolo eficiente de clonagem, expressão, purificação e cristalização da proteína Hrq1 de S.cerevisiae para estudos estruturais. Através de análise in silico foi possível determinar os domínios de clonagem que foram realizados utilizando a técnica de RFcloning. O protocolo de autoindução foi utilizado em duas estirpes de E.coli (BL21Star e Rosetta-2) para a expressão das construções. A purificação foi centrada nos domínios Cdt-1 e DUF da proteína Hrq1. O screening das condições de cristalização foi realizado apenas para o domínio DUF e alguns cristais foram obtidos embora a otimização das condições de cristalização e a coleta dos dados são as próximas etapas deste estudo.