Avaliação da biodisponibilidade dos principais metabólitos secundários do guaco a partir da forma farmacêutica xarope

Abstract

Resumo: O objetivo com este trabalho foi realizar um estudo farmacocinético da cumarina (CUM), 7-hidroxicumarina (7-HC), ácido o-cumárico (AOC) e ácido caurenóico (CAU) em voluntários sadios. Para quantificação em plasma dessas substâncias, dois métodos por CLAE-EM/EM foram desenvolvidos e validados. A pré-purificação dos analitos foi realizada por meio de extração líquido-líquido com tert-butil metil éter e através da técnica de precipitação de proteínas com acetonitrila. A cumarina, a 7-hidroxicumarina e o padrão interno (PI) 6-metilcumarina foram monitorados no modo positivo de ionização enquanto que os ácidos o-cumárico, caurenóico, isoferúlico (PI) e a prednisona (PI) no modo negativo de ionização. A separação cromatográfica foi realizada em uma coluna XBridge Shield RP18 150 x 2,1 mm (tamanho de partícula 5 ?m). Para o modo positivo de ionização a fase móvel foi composta de uma mistura de acetonitrila/água/ácido fórmico (65:35:0.05, v/v/v) eluída em modo isocrático. Para o modo negativo de ionização a fase móvel foi composta de um gradiente entre água e acetonitrila/água (95:5, v/v), ambos contendo 1 mM de formiato de amônio. Os resultados de validação mostraram que os novos métodos são seletivos e livres de efeito residual e de matriz. Os baixos limites de detecção (1,5 ng/mL para CAU, 3,0 ng/mL para CUM e 2,5 ng/mL para 7-HC e AOC) e de quantificação (5,0 ng/mL para CAU, 7,5 ng/mL para 7-HC e 10,0 ng/mL para AOC e CUM) indicaram que os novos métodos são muito sensíveis. As curvas de calibração apresentaram uma excelente correlação (r ? 0,99) nas faixas de 10,0 - 1500 ng/mL para CUM, 7,5 - 1000 ng/mL para 7-HC, 10,0 - 1000 ng/mL para AOC e 5,0 - 750 ng/mL para AOC. Nos diferentes níveis de concentração as variações de precisão e exatidão foram < 10,2%. A recuperação dos analitos e PI (> 70%) foi obtida com elevada precisão (CV < 5,0%). Sob as condições normais de trabalho, uma excelente estabilidade dos analitos foi observada tanto em plasma quanto em solução. Os métodos foram aplicados na análise da CUM, 7-HC, AOC e CAU no plasma de voluntários que receberam via oral o xarope de guaco, ou xarope de guaco fortificado com CUM. O estudo conduzido com 60 mL de xarope de guaco, em dose única, monstrou que a quantidade destas substâncias presentes no xarope não proporciona níveis plasmáticos suficientes para serem detectados pelos métodos bioanalíticos validados. A administração de 60 mL de xarope fortificado com 1500 mg de cumarina resultou em níveis plasmáticos de CUM, 7-HC e AOC suficientes para a determinação de seus parâmetros farmacocinéticos. Neste estudo foi possível verificar que a eliminação de AOC é dependente da sua taxa de formação e que AOC é um dos principais metabolitos biodisponíveis da CUM. Esses resultados reforçam a necessidade da condução de novos estudos para avaliar o potencial tóxico e terapêutico do AOC. O estudo também demonstrou que os níveis plasmáticos de 7-HC são extremamente baixos e o seu perfil farmacocinético sugere significativo metabolismo sequencial hepático com baixo acesso à circulação sistêmica. Esse estudo ainda reuniu evidências de que a administração do xarope de guaco na dose recomendada não proporciona níveis plasmáticos suficientes de CUM, 7-HC e AOC para o efeito broncodilatador esperado. Esse resultado sugere que estudos clínicos devem ser realizados para validar a eficácia deste fitoterápico. Só assim será possível garantir os benefícios do guaco, ou quem sabe impedir que recursos públicos sejam alocados para compra de medicamentos que não trazem nenhum benefício à população.

Abstract: The objective of this work was to perform a kinetic study of coumarin (COU), 7-hydroxycoumarin (7-HC), o-coumaric acid (OCA) and kaurenoic acid (KAU) in plasma of volunteers who orally received guaco syrup. For study conduction two HPLC-ESI-MS/MS methods were developed and validated. The analytes were extracted by liquid-liquid extraction using tert-butyl methyl ether and by protein precipitation using acetonitrile. COU, 7-HC and the internal standard (IS) 6-methylcoumarin were monitored in positive ion mode method, whereas OCA, KAU, isoferulic acid (IS) and prednisone (IS) in negative ion mode method. Chromatographic separation was achieved using an XBridge Shield RP18 150 x 2.1-mm (5 ?m particle size) column. For the positive ion mode, the isocratic mobile phase consisted of acetonitrile/water/formic acid (65:35:0.05, v/v/v). For the negative ion mode, the mobile phase consisted of a gradient of water and acetonitrile/water 95:5 v/v, both containing 1mM ammonium formate. Data from validation studies demonstrated that the new methods are highly selective and free of matrix and residual effects. The lower limits of detection (1.5 ng/mL for KAU, 3.0 ng/mL for COU and 2.5 ng/mL for 7-HC and OCA) and quantification (5.0 ng/mL for KAU, 7.5 ng/mL for 7-HC and 10.0 ng/mL for OCA and COU) indicated that the new methods are highly sensitive. All of the calibration curves showed excellent coefficients of correlation (r ? 0.99) over the ranges of 10.0 - 1500 ng/mL for COU, 7.5 - 1000 ng/mL for 7-HC, 10.0 - 1000 ng/mL for OCA and 5.0 - 750 ng/mL for KAU. At different levels the variations of accuracy and precision were < 10.2%. The recovery of the analytes and the IS (> 70%) was reached with high precision (RSD < 5.0%). Under normal working conditions, an excellent stability of the analytes was observed in both plasma and solutions. The methods were successfully applied for determining COU, 7-HC, OCA and KAU in plasma volunteers who orally received guaco syrup or guaco syrup spiked with COU. In volunteers who received 60 mL guaco syrup (single dose) the bioavailability of COU, 7-HC, OCA and KAU was insufficient to reach quantifiable levels of these substances. By administering 60 mL of guaco syrup spiked with 1500 mg of COU, sufficient levels of COU, 7-HC and OCA were obtained and the pharmacokinetic parameters of each compound were determined. The study demonstrated that OCA is one of the main bioavailable metabolite of COU making necessary additional studies to evaluate their toxic and therapeutic potential in humans. Analysis of pharmacokinetic parameters demonstrated that the elimination of OCA is limited to its rate formation. The study also demonstrated that the plasmatic levels of 7-HC are extremely low. The kinetic profile of 7-HC suggests sequential metabolism in the liver with low access of 7-HC to the systemic circulation. The study also evidenced that the recommended dose of guaco syrup does not provide sufficient levels of the main guaco metabolites to obtain a bronchodilation effect. Because the use of guaco have public health impact, clinical studies are necessary to prove their efficacy or to avoid public spending.