Predição e análise da expressão de RNAS não codificadores com função regulatória presentes na bactéria Herbaspirillum Seropedicae SmR1

Abstract

Resumo: Herbaspirillum seropedicae estirpe SmR1 é uma bactéria endofítica capaz de fixar nitrogênio e promover o crescimento de importantes culturas agrícolas. Seu genoma foi completamente sequenciado e anotado pelo Programa Genoma do Estado do Paraná (GENOPAR Consortium (www.genopar.org)). Esta bactéria tem um único cromossomo circular de 5.513.887 pares de base com 4.735 ORFs anotadas, as quais representam 88,3% do genoma. Em bactérias, RNAs não codificadores com função regulatória (ncRNAs) podem modular várias respostas fisiológicas e atuar por diferentes mecanismos, como pareamento de bases de RNA-RNA e interações RNA-proteína. Tecnologias de sequenciamento High-throughput, como por exemplo, a plataforma SOLiD, estão permitindo a identificação em larga escala de ncRNAs, revelando a existência de vários transcritos não-codificadores e indicando que a quantidade de ncRNAs reguladores pode ser maior do que se pensava anteriormente. Tradicionalmente, abordagens in silico para a identificação dessas moléculas envolvem a associação de sequência de promotor fator sigma70 com sequências de terminador Rho-independentes, e / ou conservação de estruturas primárias e secundárias de RNA. O objetivo deste trabalho foi identificar e avaliar a expressão de ncRNAs presentes em H. Seropedicae SmR1. Para isso, o genoma completo foi pesquisado com as ferramentas de bioinformática Gsalgorithm e nocoRNAc, que foram usadas para identificar regiões do genoma flanqueadas por sequências de promotor e sequências de terminador Rho- independentes candidatas a codificar ncRNAs. Adicionalmente, a ferramenta Cufflinks foi utilizadas para localizar regiões do genoma com consideráveis níveis de transcrição e livres de ORFS. Para avaliar a expressão dos ncRNAs, o transcriptoma de H. seropedicae SMR1 cultivada em três diferentes condições foi determinado por RNA-Seq utilizando a plataforma de sequenciamento SOLiD. Um total de 98 ncRNAs foram confirmados no conjunto de dados do transcriptoma. A comparação dos ncRNAs com os bancos de dados RFAM e RIBEX revelaram que apenas oito transcritos identificados nesse estudo já haviam sido descritos em outras espécies de bactérias, descando os seguintes: 4.5S RNA, 6S RNA (SsrS), Intron_gpI, tmRNA, and TPP Riboswitch. A função de 90 novos ncRNAs serão investigados in vivo.

Abstract: Herbaspirillum seropedicae strain SmR1 is an endophytic bacterium capable of fixing nitrogen and promoting growth of some important agricultural crops. Its complete genome was sequenced and annotated by the Paraná State Genome Program (Genopar Consortium (www.genopar.org)). This bacterium has a single circular chromosome of 5,513,887 base pairs with 4,735 annotated open reading frames, which represent 88.3% of the genome. Bacterial regulatory non-coding RNAs (ncRNA) can modulate various physiological responses acting by different mechanisms such as RNA-RNA base-pairing and RNA-protein interactions. High-throughput sequencing technology such as the SOLiD platform has allowed genome scale identification of ncRNAs, revealing the existence of several noncoding transcripts and indicating that the amount of regulatory ncRNAs can be higher than previously thought. Several computational tools have being designed to identify ncRNA in bacterial genome sequences. RNAz, sRNAFinder, sRNAPredict, sRNAscanner and Infernal have been used to identify an extensive range of new ncRNA molecules. Traditional in silico approaches for identifying ncRNAs involve the association of sigma70 promoter sequences with Rho-independent terminator sequences and/or conservation of primary and secondary RNA structures. The goal of this work was to identify and validate ncRNAs of H. seropedicaeSmR1. To accomplish this, the complete genome was screened with the bioinformatics tools GSalgorithm and nocoRNAc to identify genomic regions flanked by promoter sequences and terminator Rho-independent sequences likely to encode ncRNAs. Additionally the tool Cufflinks figured out transcript regions likely to be ncRNAs. To address the expression of the ncRNAs, the transcriptome of H. seropedicae Smr1 grown under three distinct conditions was determined by RNA-Seq in a SOLiD sequencing plataform. A total of 98 ncRNAs were confirmed in the transcriptome data set. Comparison of these ncRNAs with the RFAM database revealed that only eight transcripts had been previously described in other bacterial species, such as the 4.5S RNA, 6S RNA (SsrS), Intron_gpI, tmRNA, and TPP Riboswitch. The function of the 90 novelncRNAs will be investigated in vivo.