Obtenção de uma estirpe mutante ntrC- de Rhizobium sp. NGR234

Abstract

Resumo : O nitrogênio é o nutriente mais abundante na matéria viva, participando na composição de moléculas de ácidos nucleicos, proteínas e carboidratos, entre outras. Bactérias diazotróficas são capazes de converter N2 atmosférico a NH3, através do processo de fixação biológica de nitrogênio. Na maioria das proteobactérias o metabolismo de nitrogênio é controlado pelo sistema NTR. As proteínas NtrB e NtrC, um sistema de dois componentes, fazem parte do sistema NTR, onde, NtrB é a proteína sensora controlada pelos níveis de amônio intracelular, e NtrC um ativador transcricional controlado por NtrB. Quando o nível de amônio disponível é baixo, a proteína NtrC-P ativa a transcrição de genes envolvidos em vias alternativas para a obtenção de amônio, entre estas a fixação de nitrogênio. Rhizobium sp. NGR234 é uma bactéria diazotrófica, gram-negativa, capaz de estabelecer simbiose com cerca de 112 gêneros de legumes. Neste organismo pouco se conhece sobre o controle do metabolismo de nitrogênio e da fixação que ocorre nos nódulos. O objetivo deste trabalho foi obter uma estirpe mutante com deleção do gene ntrC de Rhizobium sp. NGR234, para possibilitar o estudo da função da proteína NtrC no metabolismo de nitrogênio deste organismo. Para tanto, foram feitas construções para a obtenção de uma estirpe mutante ntrCde NGR234. As regiões inicial e final do gene ntrC foram amplificadas e clonadas no vetor pTZ57. Estes fragmentos foram clivados e ligados ao vetor pUC18 para construir um gene truncado sem alteração na fase de leitura. O gene ntrC truncado (ntrC-Del) foi clonado no vetor pK18mobsacB e esta construção inserida em células de Rhizobium sp. NGR234. As células que sofreram dupla recombinação foram selecionadas em meio contendo sacarose.