Efeitos da N-N' - difenil-4-metoxi-benzamidina sobre parâmetros do metabolismo energético em mitocôndrias e hepatócitos

Abstract

Resumo: As amidinas têm como característica química a presença de dois átomos de nitrogênios ligados ao mesmo átomo de carbono. Para estes compostos diversas atividades biológicas são descritas. A pentamidina, uma diamidina aromática, é eficaz no tratamento de Pneumocystis carinii e de leishmanioses, porém, causa graves efeitos colaterais. Por isso, novos derivados de amidina têm sido sintetizados, dentre estes a N-N'-difenil-4-metoxi-benzamidina (metoxiamidina), que se mostrou efetiva contra L. amazonensis (LD50 20 ?mol/L) e T. cruzi (LD50 59 nmol/L). Neste estudo, a toxicidade da metoxiamidina foi avaliada em mitocôndrias e hepatócitos isolados. Em mitocôndrias oxidando ativamente glutamato e malato, o composto inibiu o estado 3 da respiração (25 nmol/mg de proteína) em ~15%, sendo os sítios de inibição o complexo I e o segmento entre a ubiquinona e o complexo III. A metoxiamidina estimulou o estado 4, nas concentrações de 50 e 65 nmol/mg de proteína em ~32% e ~43%, respectivamente. Como consequência destes efeitos, os valores do coeficiente de controle respiratório (CCR) e a razão ADP/O foram diminuídos. O efeito desacoplador da metoxiamidina, sugerido pelo estímulo do estado 4, foi confirmado pelo aumento do consumo de oxigênio no estado 4 induzido por oligomicina, chegando a ~69% (65 nmol/mg de proteína), e pelo aumento da atividade ATPásica em mitocôndrias intactas, em ~27% e ~64% para 50 e 65 nmol/mg de proteína, respectivamente. Mitocôndrias na presença de acetato de sódio tiveram seu inchamento inibido nas maiores concentrações do composto (50-65 nmol/mg de proteína, em ~16 e 32% respectivamente). Também o inchamento de mitocôndrias desenergizadas, na presença de K+ e valinomicina, foi inibido em ~20% nas mesmas concentrações, sugerindo que a metoxiamidina altera a permeabilidade e fluidez da membrana mitocondrial. Em modelo experimental de hepatócitos isolados, foram comparados os efeitos da metoxiamidina e pentamidina, nas concentrações de 25 e 65 ?mol/L. Nos ensaios de respiração em hepatócitos em suspensão, os resultados da metoxiamidina estão de acordo com os obtidos com mitocôndrias isoladas, com diminuição da respiração basal (~8% - 65 ?mol/L) e desacoplado (~26% - 65 ?mol/L) e aumento no estado leak (~47% - 65 ?mol/L). Para a pentamidina, os resultados foram semelhantes, com exceção para o estado leak, ocorrendo diminuição do consumo de oxigênio no estado basal (~18% - 65 ?mol/L) e desacoplado (~18% - 65 ?mol/L). Nestas células, os níveis piruvato não foram alterados pela presença dos compostos, mas os níveis de lactato aumentaram em ~17% na maior concentração (65 ?mol/L) de metoxiamidina no tempo de 40min. Em cultura de hepatócitos, o tratamento de 18h com metoxiamidina alterou a viabilidade celular, avaliada pelos métodos do MTT e atividade da enzima LDH, promovendo maior número de células viáveis (~68% para MTT e ~60% para LDH - 65 ?mol/L). Já a pentamidina (65 ?mol/L) diminuiu em ~68% e 258% a viabilidade dos hepatócitos, como resultados dos métodos do MTT e LDH, respectivamente. Conclui-se que a metoxiamidina, em concentração similar a LD50 (20 ?mol/L) para L. amazonensis, compromete de maneira discreta a bioenergética mitocondrial. Este efeito também foi observado em hepatócitos em suspensão, porém, nestas células em cultura, o composto parece exercer um efeito citoprotetor.

Abstract: Amidines are chemically characterized by the presence of two nitrogen atoms bound to the same carbon atom in its structure. To these compounds several biological activities have been described. Pentamidine, an aromatic diamidine, is effective in the treatment of Pneumocystis carinii and leishmaniasis; however, this compound promotes severe side effects. For this reason, new amidine derivatives have been synthesized, among them the N-N'-diphenyl-4-methoxy-benzamidine (methoxyamidine), which was effective against L. amazonensis (LD50 20 ?mol/L) and T. cruzi (LD50 59 nmol/L). In the present study, the toxicity of methoxyamidine was evaluated in mitochondria and isolated hepatocytes, wich was immediately used (suspension cells) or maintained in culture for 18 h. In mitochondria actively oxidizing glutamate and malate, the compound inhibited the state 3 respiration (25 nmol/mg of protein) by ~15% and the inhibition sites were the complex I and the segment between ubiquinone and complex III. Methoxyamidine also stimulated the state 4 respiration, at concentrations of 50 and 65 nmol/mg of protein by ~32% and ~43%, respectively. As a consequence of these effects, the respiratory control coefficient values (CCR) and the ADP/O ratio were decreased. The uncoupling effect of methoxyamidie, suggested by the stimulation of state 4 respiration, was confirmed by the dose dependent increase of oxygen consumption in state 4 induced by oligomycin, reaching to ~69% (65 nmol/mg of protein), and by the increased ATPase activity in intact mitochondria, by ~27% and ~64% to 50 and 65 nmol/mg of protein, respectively. Swelling supported by oxidation of glutamate plus malate in the presence of sodium acetate was inhibited by methoxyamidine by ~16 and 32% at concentrations of 50-65 nmol/mg of protein, respectively. Also the mitochondrial swelling in the absence of substrate and in the presence of K+ and valinomycin, was inhibited by ~20% at the same concentrations, suggesting that methoxyamidine affects the mitochondrial membrane permeability and fluidity. In isolated hepatocytes, the effects of methoxyamidine and pentamidine were compared, at concentrations of 25 and 65 ?mol/L. In the respiration assays with suspension cells, the results of methoxyamidine were compatible with those obtained in isolated mitochondria, with a decrease in basal (~8% - 65 ?mol/L) and uncoupled (~26% - 65 ?mol/L) respiration states. Leak state was stimulated by ~47% by methoxyamidine (65 ?mol/L). For pentamidine the results were similar. Basal and uncoupled cellular respiration was inhibited at ~18% by pentamidine (65 ?mol/L). In suspension cells, pyruvate levels were not affected by the compounds whereas lactate levels were increased by ~17% in the highest concentration (65 ?mol/L) of methoxyamidine after 40min of incubation. In hepatocytes maintained in culture, the methoxyamidine treatment (65 ?mol/L - 18 h) increased the cell viability by ~68% and ~60%, evaluated by MTT and LDH activity, respectively. Pentamidine (65 ?mol/L - 18 h) decreased in ~68% and 258% the hepatocyte viability, evaluated by MTT and LDH activity, respectively. Taken together these results show that methoxyamidine at concentration similar to LD50 (20 ?mol/L) for L. amazonensis, promotes discreet effects on mitochondrial bioenergetics. These effects were also observed in suspension hepatocytes; however, when these cells were maintained in culture, the compound seemed to exert a citoprotector effect.