Análise epigenética de células-tronco mesenquimais na indução adipogênica

Abstract

Resumo: A diferenciação celular é acompanhada por mudanças no perfil da expressão gênica. Mecanismos epigenéticos envolvendo estrutura da cromatina e arquitetura nuclear regulam estas alterações. A diferenciação adipogênica de células-tronco mesenquimais isoladas da medula óssea (CTMs-MO) ou de tecido adiposo (CTMs-TA) foi utilizada como modelo para investigar estes mecanismos. A análise da lâmina nuclear, dos nucléolos e das histonas modificadas me/2me/3meH3K4, 3meH3K9, 3meH3K27, H2AZ e acH3 permitiu estabelecer um modelo inicial das alterações ocorridas. Os efeitos dos mecanismos epigenéticos na diferenciação adipogênica foram investigados utilizando-se os agentes modificadores de cromatina tricostatina A (TSA), um inibidor de histona desacetilases, e 5-aza-2'-deoxicitidina (5azadC), um agente desmetilante. Culturas subconfluentes de CTMs foram tratadas com 5, 50 ou 500 nM de TSA ou com 1, 10 ou 100 nM de 5azadC durante dois dias antes de se iniciar a indução da adipogênese. Após 14 dias, a diferenciação foi quantificada pela absorbância do corante Oil Red O e a expressão dos genes adipogênicos PPARG e FABP4, e do gene anti-adipogênico GATA2 foi avaliada por qPCR. O tratamento com 500 nM de TSA significativamente aumentou a expressão de acH3, embora a proliferação celular tenha diminuído nesta concentração. A TSA significativamente reduziu a adipogênese, exceto o tratamento com 5 nM em CTMs-MO. No entanto, houve associação parcial entre diferenciação e expressão gênica. O tratamento com 5azadC significativamente diminuiu a diferenciação adipogênica em todas as condições avaliadas e isto resultou na regulação negativa de PPARG e FABP4, e positiva de GATA2. Embora o conteúdo de DNA não tenha mudado nos tratamentos com 5azadC, a proliferação celular foi reduzida 24 horas após o término dos tratamentos. A resposta aos tratamentos foi mais acentuada em CTMs-TA do que em CTMs-MO, sugerindo a existência de distintas memórias epigenéticas conforme a origem celular. Como a assinatura epigenética afeta a diferenciação, ao se conhecer qual a linhagem-alvo preferencial daquela fonte de CTM, é possível direcionar seu uso nas terapias celulares. Assim, cada tipo celular teria uma aplicação específica visando melhorar a eficiência do processo de diferenciação.

Abstract: Cellular differentiation is followed by alterations in the pattern of gene expression. Epigenetic mechanisms involving chromatin structure and nuclear architecture regulate these changes. Adipocyte differentiation of mesenchymal stem cells isolated from bone marrow (BM-MSCs) or adipose tissue (ADSCs) were used to investigate these changes. Analysis of nuclear lamin, nucleoli, histone modifications me/2me/3meH3K4, 3meH3K9, 3meH3K27, H2AZ and acH3 resulted in an initial model of the changes found. The effects of these epigenetic mechanisms in adipocyte differentiation were investigated using the chromatin-modifying agents, trichostatin A (TSA), a histone deacetylases inhibitor, and 5-aza-2'-deoxycytidine (5azadC), a demethylating agent. Subconfluent MSCs cultures were treated with 5, 50 or 500 nM of TSA or with 1, 10 or 100 ?M of 5azadC for two days before starting adipogenesis induction. After 14 days, differentiation was quantified by absorbance of Oil Red O stain, and the expression of the adipocyte genes, PPARG and FABP4, and of the anti-adipocyte gene, GATA2, was evaluated by qPCR. Treatment with 500 nM of TSA significantly increased acH3 expression, although cell proliferation had been decreased in this concentration. TSA significantly reduced adipogenesis, except treatment with 5 nM in BM-MSCs. However, there was a partial association between differentiation and gene expression. 5azadC treatment significantly decreased adipocyte differentiation in all conditions evaluated, and this resulted in downregulation of PPARG and FABP4, and upregulation of GATA2. Although, DNA content did not change with 5azadC treatment, cell proliferation was reduced 24 h after completion of treatments. Treatment response was stronger in ADSCs than in BM-MSCs, suggesting the existence of distinct epigenetic memories according to cell origin. As epigenetic signatures affect differentiation, to know the preferential lineage target of the MSC source could direct the use of MSCs in cell therapies. Thereby, each cell source would have a specific application aiming to improve the differentiation process efficiency.