Caracterização in silico, clonagem, superexpressão e purificação da proteína trealose-6-fosfato fosfatase de Herbaspirillum seropedicae

Abstract

Resumo : Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria diazotrófica, gram-negativa e capaz de colonizar gramíneas. Como muitas outras espécies, ela também possui a capacidade de sintetizar o dissacarídeo trealose a partir de UDP-glucose e glucose6-fosfato. A trealose é um açúcar essencial para a célula em condições ambientais extremas, como seca e salinidade elevada, pois interage com as proteínas e lipídeos, estabilizando a sua conformação. O acúmulo de trealose em plantas de interesse econômico é essencial para aumentar a capacidade de sobrevivência frente a condições ambientais adversas. Isto pode ser alcançado introduzindo e superexpressando os genes da síntese da trealose de outras espécies em células vegetais. Em H. seropedicae, a via de biossíntese da trealose é formada por dois genes: o otsA, codifica a trealose-6-fosfato sintase (TPS) e o otsB, codifica a trealose-6-fosfato fosfatase (TPP). O objetivo deste trabalho é a caracterização da proteína TPP. A proteína TPP é membro da superfamília HAD (dehalogenase haloácida), caracterizada por dobras a/ß-hidrolase na estrutura das enzimas e pela utilização de um resíduo de aspartato como nucleófilo na reação catalisada. Através da análise comparativa com a TPP de Thermoplasma acidophilum, gerou-se um modelo tridimensional teórico para a TPP de H. seropedicae. O modelo mostrou que a proteína possui um domínio central com dobras a/ß-hidrolase e um possível cap do tipo C2. Além disso, observou-se evidente semelhança na composição e distribuição espacial dos aminoácidos que compõem o sítio ativo das TPPs dos dois organismos, sugerindo afinidade pelo mesmo tipo de substrato. O gene otsB foi amplificado a partir do DNA cromossomal da bactéria e clonado no vetor de expressão pET-28a. A proteína TPP foi então superexpressa e purificada por cromatografia de afinidade. Os ensaios enzimáticos foram realizados utilizando p-nitrofenol fosfato (pNPP) como substrato e indicaram que a enzima possui atividade ótima a 50ºC, em tampão PIPES pH 6,1. A atividade da TPP mostrou-se dependente de Mg2+, indicando ser este o provável cofator da enzima, e suscetível à inibição competitiva por Ca2+. Este trabalho inicia a caracterização dos genes da via de biossíntese de trealose em Herbaspirillum seropedicae. Uma vez concluído, o estudo permitirá uma melhor compreensão da potencialidade e eficiência das enzimas deste organismo envolvidas na produção final do dissacarídeo.