Efeito da proteína FNR na fixação biológica de nitrogênio em Herbaspirillum seropedicae

Abstract

Resumo : O interesse pelo estudo dos organismos fixadores de nitrogênio, os diazotrofos, tem aumentado nos últimos anos. Sendo biofertilizantes em potencial, estes organismos, constituem uma alternativa à utilização dos fertilizantes nitrogenados, que encarecem a produção agrícola e ainda podem provocar sérios danos ecológicos. A Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) é um processo amplamente distribuído em Bacteria e Archaea. Herbaspirillum seropedicae é um diazotrofo endofítico, pertencente a classe ß das Proteobactérias encontrado em gramíneas importantes para a agricultura, como trigo, arroz, sorgo e cana-de-açúcar. O processo de redução de N2 atmosférico a amônio, é catalisado pelo complexo enzimático nitrogenase, codificada pelos genes nif, os quais têm sua transcrição ativada pela proteína NifA. A atividade da proteina NifA é controlada em resposta aos níveis de oxigênio e amônio. A resposta a íons amônio ocorre por meio de seu domínio N-terminal. Já o mecanismo de resposta ao oxigênio, ainda carece de uma boa compreensão, muito embora, haja a suspeita de que a NifA, possa monitorar diretamente o oxigênio intracelular por meio de um motivo de cisteínas, localizado entre os domínios central e C-terminal da proteína. A partir de evidências da participação da proteína FNR no metabolismo do nitrogênio em Klebsiella pneumoniae (GRABBE, KLOPROGGE E SCHMITZ, 2001), em 2003 Monteiro e colaboradores obtiveram resultados que indicam que a sensibilidade da NifA Ntruncada de Herbaspirillum seropedicae ao oxigênio está relacionada com a proteína FNR de Escherichia coli. Também em 2003, Raeder, sugeriu que mutantes cromossomais de H. seropedicae nos genes fnr1 e fnr2 tinham atividade de nitrogenase diminuída. O fator de transcrição FNR tem um importante papel no monitoramento dos níveis de oxigênio em diversos organismos. Em Herbaspirillum seropedicae, a proteína FNR, é uma forte candidata à participação na via de regulação da NifA em resposta ao oxigênio. O objetivo deste trabalho foi determinar o efeito da proteína FNR sobre a fixação de nitrogênio em H. seropedicae. Para isso foram construídos mutantes de Herbaspirillum seropedicae nos genes fnr1 e fnr2. Depois da amplificação dos genes por PCR, estes foram clonados no vetor pGEM-T easy. Após a confirmação da clonagem por meio de padrão de restrição e sequenciamento de DNA, os genes foram subclonados no vetor suicida pSUP202, e então foi inserido um cassete de DNA que confere resistência ao antibiótico canamicina nos genes fnr. Estes plasmídeos foram então transferidos para o H. seropedicae (SmR1) e possíveis mutantes gerados por recombinação homóloga foram isolados. Os resultados preliminares, indicando que mutantes fnr2- têm atividade de nitrogenase diminuída, sugerem que a proteína FNR2 de Herbaspirillum seropedicae possa estar envolvida na fixação biológica de nitrogênio neste organismo. Além disso, foi encontrado na região promotora do gene fnr2 de H.seropedicae um provável promotor s 54 e uma provável upstream activator sequence para a proteína NifA, reforçando a hipótese da participação deste gene no metabolismo do nitrogênio. Devido ao envolvimento global da proteína FNR no metabolismo celular do oxigênio em diversos organismos, novos experimentos precisam ser realizados para determinação do papel proteína FNR na regulação da FBN neste organisnmo.