Associação do polimorfismo gênico da lectina ligante de manose e da ficolina-2 na doença de chagas crônicas

Abstract

Resumo: A doença de Chagas (DC), causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi é considerada uma doença negligenciada, afetando cerca de 10 milhões de indivíduos em todo o mundo. Não existem medicamentos eficazes para combater a infecção crônica, nem tão pouco marcadores de prognóstico e evolução da DC. A lectina ligante de manose (MBL) e a ficolina-2 são moléculas de reconhecimento de padrões moleculares, que se ligam a epítopos presentes em diferentes patógenos, incluindo o T. cruzi, promovendo a fagocitose e a lise mediada pela ativação do complemento. As concentrações séricas de MBL são geneticamente determinadas por polimorfismos de nucleotídeo simples no gene MBL2, os quais afetam significativamente a expressão da proteína. Os polimorfismos -221 (H/L) e -550 (X/Y), presentes no promotor de MBL2, +4 (P/Q) na região 5' não traduzida e as variantes A/D/B/C do exon 1 foram investigados através de sequenciamento gênico em 196 pacientes chagásicos crônicos com as diferentes formas clínicas da DC. Investigaram-se ainda os polimorfismos -986G>A, -602G>A e -4A>G presentes no promotor do gene FCN2, além da variante A258S no exon 8 do referido gene, em 243 pacientes com DC crônica, através de PCR em Tempo Real. Como controles, 196 indivíduos saudáveis foram investigados para MBL2 e 305 para FCN2 (sendo 135 para o exon 8). Os níveis plasmáticos de ficolina-2 foram quantificados, através de ELISA, em 160 desses pacientes e 71 controles. Um efeito protetor contra a DC sintomática foi observado para o haplótipo MBL2*LYQC (p=0.034, OR=0.22 IC 95% 0.049-0.98). Genótipos funcionais relacionados com a deficiência de MBL (YC/YC e YA/YC) foram ausentes nas formas sintomáticas da DC (p=0,015), enquanto que XA/YO e YO/YO foram associados com a gravidade da forma cardíaca (p=0.0048, OR=0.10, IC 95% 0.02-0.54), sugerindo um efeito protetor da deficiência de MBL na progressão da DC crônica. Pacientes chagásicos apresentaram níveis de ficolina-2 diminuídos em relação aos controles (p<0.0001). Entre os pacientes com a forma cardíaca da DC, foram observadas diferenças significativas nos níveis de ficolina-2 entre as classes funcionais de insuficiência cardíaca (p=0.039). Níveis diminuídos de ficolina-2 foram associados com a variante FCN2*258S nos pacientes (p=0.034). Além disso, heterozigotos FCN2*-4A/G foram menos frequentes em pacientes cardíacos do que em controles (OR=0.56,IC 95% =0.33-0.94, p=0.034), sendo que a mesma tendência foi observada ao comparar cardíacos com indeterminados (OR=0.55; IC 95%= 0.29-1.04; p=0.077). No entanto, heterozigotos FCN2*-4A/G com as variantes FCN2*258S do exon 8 e homozigotos FCN2*258S foram mais freqüentes na forma cardiodigestiva, tanto em relação aos controles (OR=14.1,IC 95% = 3.5-56.8, p=0.0001) como aos indeterminados (OR=3.2, IC 95% = 1.1-9.4, p=0.037). A partir destes resultados pode-se sugerir que a genotipagem dos polimorfismos de MBL2 e da variante FCN2*A258S, bem como as concentrações séricas de MBL e ficolina-2 podem ser úteis como possíveis biomarcadores a fim de monitorar a atividade e progressão da DC.

Abstract: Chagas disease (CD), caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is considered an important neglected tropical disease, affecting approximately ten million people around the world. There are no effective drugs to combat chronic infection or markers of prognosis and evolution of CD. Mannan binding lectin (MBL) and Ficolin-2 are soluble pattern-recognition molecules which bind to sugar moieties of different pathogens, including T. cruzi, promoting phagocytosis and lysis by activation of the lectin pathway of complement. A role for MBL in the host resistance against T. cruzi infection and in myocardial inflammation has been reported in experimental as well as clinical studies. MBL levels are genetically determined by single nucleotide polymorphisms in MBL2 gene, which affect significantly serum levels of the protein. We investigated MBL2 polymorphisms -221 (H/L), -550 (X/Y) in the promoter, +4 (P/Q) in the 5' untranslated region and the exon 1 variants (A/D/B/C) by sequencing in 196 chronic CD patients presenting, indeterminate, cardiac, digestive and associated clinical forms. We also investigated FCN2 polymorphisms (-986G>A, - 602G>A, and -4A>G in the promoter and A258S in exon 8) using Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) based real-time PCR assay in 243 patients, presenting the different clinical manifestations of chronic CD. As controls, 196 healthy individuals were investigated for MBL2 and 305 for FCN2 (being 135 for exon 8). In addition, ficolin-2 levels were quantified by ELISA in 160 chronic CD patients and 71 healthy individuals. A protective effect against symptomatic CD was observed for the MBL2*LYQC haplotype (p=0.0342; OR=0.2185; CI 95% 0.0488 - 0.9787). In addition, functional MBL2* genotypes related to MBL deficiency (YC/YC and YA/YC) were absent in CD symptomatic forms (p=0.015) when compared with controls while XA/YO and YO/YO were related to the severity of cardiac commitment (p=0.0048 OR=0.10, CI 95% 0.02-0.54), suggesting a protective effect of MBL deficiency against chronic chagasic cardiomyopathy. CD patients presented lower ficolin-2 plasma levels than controls (p <0.0001). Among the different groups of cardiac commitment, individuals with the less severe form had higher ficolin-2 levels (p=0.039). Lower ficolin-2 levels were found associated with the 258S variant in the patients (p=0.034). A lower frequency of -4A/G heterozygotes was observed in cardiac patients than in controls (OR=0.56, 95%CI= 0.33-0.94, p=0.034). Heterozygote FCN2* -4A/G genotypes with the 258S variant and 258S homozygotes were nevertheless more frequent among cardiodigestive patients when compared to controls (OR=14.1,95% CI=3.5-56.8, p=0.0001) and to indeterminate patients (O.R.=3.2,95%CI=1.1-9.4, p=0.037). We also found an association of 258S variant with cardiodigestive CD form compared to the controls (OR=2.24,95%CI=1.1-4.5, p=0.037). These results suggest that MBL2 genotyping and FCN2* A258S variant, as well as MBL and ficolin-2 levels may be useful as possible biomarkers of activity and progression of CD.