Formação e caracterização de cristais de proteínas usando métodos de filmes finos

Abstract

Resumo: A cristalização da lisozima sobre a superfície de grade de cobre revestida com filme fino de carbono bacteriano(GC) para microscopia de transmissão foi analisada por microscopia de força atômica (MFA) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). A lisozima é uma proteína globular, que atua como enzima antibacteriana, hidrolisando uma porção da parede celular de algumas bactérias, sendo assim conhecida como um antibiótico natural. A solução da lisozima foi depositada por diferentes métodos sobre a superfície de GC. Além da deposição da solução de lisozima, foram também utilizadas nano partículas (NP) de ouro como nucleantes. Os cristais formados com e sem NP de Au e em diferentes concentrações, foram analisados por MET e por MFA. As imagens topográficas de MFA não mostram diretamente as NP de Au, devido a irregularidade da superfície da GC, comprometendo o uso do MFA nesta análise. A análise de Espalhamento Dinâmico de Luz (EDL) da solução de lisozima mostra aglomerados com dimensões comparáveis com unidades protéicas, sugerindo que não ocorre cristalização antes da deposição na GC. A análise das imagens de difração de elétrons obtidas por MET sugerem que houve formação de cristais de lisozima com parâmetros de rede a=3,1nm, b= 5,25nm e c= 8,9 nm. O maior número de cristais tanto na forma monocristalina, quanto policristalina ocorreu nos filmes preparados com NP de Au e com baixas concentrações (10 M) de proteína e menores tempo de incubação.

Abstract: Lysozyme crystal were prepare on Transmission Electronic Microscope (TEM) Carbon coated grids (CG). Lysozyme is a globular protein that acts as an enzyme hydrolyzing the wall of bacterium, being known as natural antibiotic. The lysozyme solution was deposited on CG by different methods. In addition to the deposition of lysozyme itself, gold nano particles (NP) were also used as nucleant. TEM and Atomic Force Microscopy (AFM) were used to search the formation of crystals. Topographic AFM images cannot show direct evidences of Au NP due to the large irregularity of CG surface, jeopardizing the advantage of AFM. DLS analysis of lysozyme solution shows particles with size compared to the protein unit dimensions, suggesting that crystallization occurs after protein being deposited on CG. TEM images and diffraction patterns suggest the formation of orthorhombic lysozyme crystals with lattice parameters of a=3.1 nm , b=5.25nm and c=8.9nm. The largest number of crystal, either single or polycrystalline were found for the samples prepared with Au NP and at low lysozyme concentration 10 M with the shortest incubation time (5 s).