RNA dupla fita em Guignardia Citricarpa : obtenção, cura, transmissão e alterações fenotípicas

Abstract

Resumo: Guignardia citricarpa é um ascomiceto de extrema importância para a citricultura brasileira, pois é o agente causal da Mancha Preta dos Citros. Alguns isolados desta espécie apresentam infecção por vírus de RNA dupla fita (RNAdf) com efeitos fenotípicos ainda desconhecidos. No presente estudo, sete isolados de G. citricarpa, previamente identificados como portadores de RNAdf, foram estudados. Estes isolados foram obtidos de 1996 a 2008, sendo um proveniente do estado do Paraná, cinco de São Paulo e um da África do Sul. Diferentes protocolos de purificação de RNAdf foram investigados e o melhor rendimento foi com a utilização de fenol ácido (pH 4,7). Uma das formas de se analisar a influência do RNAdf é através da obtenção de linhagens isogênicas, que diferem entre si pela presença ou ausência de RNAdf. Com o objetivo de obtenção de linhagens isogênicas, dois protocolos de cura do RNAdf e um de transmissão de RNAdf foram utilizados. Para a cura, foi feito o repique em meio com ciclohexamida, conforme relatado na literatura. Para G. citricarpa este método não foi eficiente, pois o fungo teve seu crescimento completamente inibido mesmo em baixas concentrações (0,5 µg/mL). Outro protocolo de cura utilizado foi repique de pontas de hifas em condições de cultura a 35ºC, ao invés da cultura a 28ºC, criando uma condição de estresse térmico para o fungo. Dos sete isolados investigados, apenas três apresentaram crescimento nestas condições. Destes, dois isolados produziram onze setores que foram investigados quanto à presença de RNAdf. Em nove não foram observadas bandas de RNAdf após eletroforese de gel de agarose. Neste momento, estes foram considerados curados do RNAdf. Para a transmissão, foi necessário selecionar isolados de G. citricarpa com características que os diferenciassem, além da presença/ausência de RNAdf. Isolados foram investigados quanto ao padrão de bandas de RAPD, porém, não foi possível diferenciá-los. Optou-se por utilizar uma característica morfológica, a presença ou ausência de halo amarelo em meio aveia. Os isolados com RNAdf são positivos para esta característica. Foram selecionados doze isolados de G. citricarpa sem RNAdf, negativos para esta característica. Após avaliar a compatibilidade destes isolados com um isolado com RNAdf, experimentos de transmissão foram conduzidos. 27 colônias que não formaram halo em meio aveia, provenientes de conídios da área de contato entre os isolados, foram investigadas quanto à presença de RNAdf e 7 delas (28,92%) receberam RNAdf. As linhagens isogênicas foram investigadas quanto à morfologia da colônia e foi possível verificar que as linhagens com RNAdf apresentam um menor diâmetro da colônia após 15 dias de cultura. Testes estatísticos comprovaram esta observação. Com o objetivo de sequenciar o genoma deste vírus, foi aperfeiçoado o protocolo de obtenção de seu cDNA. Este foi obtido e nas próximas etapas desta pesquisa, deverá ser sequenciado. Esta sequência servirá para completar a análise filogenética de vírus da família Totiviridae realizada neste trabalho. Os respectivos fungos hospedeiros destes vírus também foram enquadrados filogeneticamente por meio de sequências da região ITS1-5,8S-ITS2. No entanto, a análise dessa região não forneceu indícios de co-evolução entre vírus e hospedeiro.

Abstract: Guignardia citricarpa is an ascomycete of extreme importance for the brazilian citrus culture, since it's the causal agent of Citrus Black Spot. Some isolates of this species are infected with a double stranded RNA virus (dsRNA), which causes unknown phenotypical symptons, yet. Seven isolates from this species previously identified as bearing dsRNA, were studied. These isolates were obtained from 1996 to 2008, one from the state of Paraná, five from the state of São Paulo and one from South Africa. Different dsRNA purification protocols were investigated and the best dsRNA yield was made with the use of acid phenol (pH 4,7). One of the ways to analyze the influence of dsRNA is through isogenic strains, which differ from one another by the presence or absence of this genetic material. Two cure and one transmission protocol were used for the obtainment of isogenic strains. Regarding the cure experiment, cycloheximide was added to the medium where mycelial plugs were placed, as described in the literature. This method wasn't efficent for G. citricarpa because the fungal growth was completely inhibited, even when 0,5 µg/mL of the compound was used. The other cure protocol consisted of growth of hyphal tip sections at 35 ºC, instead of 28 ºC, which is a stressing condition. From the seven isolates submitted to this treatment, only three managed to grow at these conditions. From these, only two produced eleven sectors which were investigated regarding the presence of dsRNA. In nine, no dsRNA bands were observed in agarosis gel after electrophoresis. At this moment they were considered cured from the dsRNA. For the transmission of dsRNA, it was necessary to select G. citricarpa isolates with some characteristics that would allow their differentiation from other strains, asides from the presence/absence of dsRNA. Isolates were investigated regarding their RAPD banding pattern, however, they were all the same. It was opted to use a morphological characteristic, the presence or absence of a yellow halo in oatmeal medium. All isolates with dsRNA are positive for this characteristic, and twelve isolates with no dsRNA and negative for the halo were chosen. After hyphal compatibility was assessed on these isolates, by pairing a dsRNA bearing isolate with a dsRNA-free one, transmission experiments were performed. Twenty seven colonies that didn't present the yellow halo in oatmeal medium, all of which came from conidia from the contact zone between isolates, were investigated for the presence of dsRNA and seven of them (28,92%) received this molecule. Isogenic strains were then tested for colony morphology and it was possible to verify that dsRNA bearing strains had a significant smaller size after fifteen days of growth. Statistical analysis corroborated this trait. Aiming to sequence this viral genome, the cDNA production protocol was optimized. This molecule was yielded and in the next phases of this research, should be sequenced. This sequence will allow completing the phylogenetic analysis of viruses from the Totiviridae family performed in this study. The respective fungal hosts of these viruses were also phylogenetically grouped by their ITS1-5,8S-ITS2 region sequences, in order to identify a co-evolutive trait among these viruses and their hosts. However, the analysis of this region didn't provide evidences of this relation.