Determinação do ácido Rosmarínico em Salvia Officinalis L., Lamiaceae, e avaliação de sua toxicidade e influência na Melanogênese

Abstract

Resumo: O acido rosmarinico e um ester dos acidos cafeico e 3,4-di-hidroxifenillatico, encontrado em diversas especies vegetais, tais como a Salvia officinalis L. (salvia) e o Rosmarinus officinalis (alecrim). Apresenta diversas atividades biologicas, tais como antiseptica, antioxidante, antiinflamatoria, antiviral, hipoglicemiante, antitumoral e neuroprotetora. Prevendo o possivel uso do acido rosmarinico como farmaco e considerando seu amplo uso pela populacao atraves da salvia, tanto a substancia como a especie devem ser objeto de estudo na area analitica e com relacao as suas atividades biologicas. O presente trabalhoteve por objetivo isolar o acido rosmarinico da salvia, otimizar e validar um metodo de extracao e determinacao deste analito na materia-prima vegetal, e avaliar a toxicidade e a influencia do acido rosmarinico e de extratos de salvia na melanogenese. Para o isolamento do acido rosmarinico usou-se um extrato comercial de salvia que foi submetido a fracionamento cromatografico. O acido rosmarinico isolado foi identificado por RMN de 1H e 13C e por espectrometria UV-VIS. Em seguida, realizou-se a otimizacao das melhores condicoes para extracao do acido rosmarinico de salvia atraves de planejamento fatorial de experimentos, partindo-se de 100 mg de material vegetal com tamanho de particula entre 310 e 740 ƒÊm. Diluicao da droga em 10 mL de metanol 40%, contendo 1 mg/mL de acido ascorbico e 10 mM de EDTA, sonicacao por 20 minutos a 45 ‹C, com posterior filtracao e diluicao para injecao em cromatografo, foram as melhores condicoes estabelecidas para a extracao do analito. Todas as amostras foram analisadas por CLAE em coluna C18, eluidas com metanol:agua (acidificada) nas proporcoes 45:55 (v/v) ate 5 min. e 80:20 (v/v) de 5 a 10 min. de corrida, com fluxo de 1 mL/min. e deteccao em 330 nm. O metodo foi posteriormente submetido a validacao, com analise dos aspectos especificidade, seletividade, linearidade, faixa de aplicacao, precisao repetibilidade e intermediaria e exatidao. Todos os testes obtiveram resultados dentro do especificado pela legislacao, possibilitando o uso do metodo para o fim desejado. A avaliacao das atividades biologicas foi feita com o acido rosmarinico isolado, com um extrato fluido 1:1 e com uma infusao 1:10 de salvia. Todos foram avaliados com relacao a toxicidade a nauplios da A. salina. Nenhum deles apresentou toxicidade significativa (CL50 > 1000 ƒÊg/mL). As mesmas amostras foram tambem testadas com relacao a toxicidade as linhagens celulares McCoy e B16F10. A linhagem McCoy foi mais sensivel aos tratamentos principalmente nas maiores concentracoes. A linhagem celular de melanoma murino B16F10 apresentou maior resistencia aos tratamentos, e as concentracoes dos testes que nao apresentaram toxicidade a essa linhagem foram avaliadas quanto a influencia na melanogenese. Para tal, culturas de celulas B16F10, tratadas por 24 horas com as diferentes concentracoes de acido rosmarinico e de extratos de salvia, tiveram a concentracao de melanina e de atividade de tirosinase celular determinadas. Lisados de celulas nao tratadas previamente foram incubados por 60 min. a 37 ‹C, na presenca de L-DOPA e dos testes para determinacao da atividade de tirosinase invitro. A partir dos experimentos foi possivel verificar que o acido rosmarinico apresenta dupla acao melanogenica, sendo capaz de aumentar a sintese de melanina e de tirosinase em concentracoes mais baixas (10 ƒÊM) e de inibi-la em concentracoes mais altas (1000 ƒÊM). Esta substancia foi uma das responsaveis pela inducao da sintese de melanina pelo extrato fluido e pela infusao de salvia na concentracao de 10 ƒÊM de acido rosmarinico. Mas os extratos nao influenciaram a atividade de tirosinase da mesma forma que o acido rosmarinico, em consequencia das acoes de outras substancias presentes nos mesmos. A partir deste trabalho desenvolveram-se metodologias de extracao e determinacao que podem facilitar o estudo do acido rosmarinico e da salvia nas mais diversas areas da pesquisa cientifica e, ainda, ampliou-se o conhecimento das atividades biologicas do acido rosmarinico e da salvia, abrindo espaco para estudos mais aprofundados de ambos na pesquisa e desenvolvimento de novos farmacos e/ou fitoterapicos para tratamento de patologias pigmentares.

Abstract: Rosmarinic acid is an ester of caffeic and 3,4-dihydroxyphenyllactic acids, found in many species, such as Salvia officinalis L. (sage) and Rosmarinus officinalis (rosemary). He has several biological activities, such as antiseptic, antioxidant, anti-inflammatory, antiviral, hypoglycemic, antitumor and neuroprotective. Predicting the possible use of rosmarinic acid as a therapeutical drug and considering its idespread use by the population through the sage, both the substance and the species should be studied in the analytical and in relation to their biological activities. This study aimed to isolate the rosmarinic acid from sage, to optimize and validate a method of extraction and determination of this analyte in plant material and to evaluate the toxicity and the influence of rosmarinic acid and sage on melanogenesis. For the isolation of rosmarinic acid a commercial extract of sage was submitted to chromatographic separation. Isolated rosmarinic acid was identified by 1H NMR and 13C and UV-VIS spectrometry. After this, the optimization of the best conditions for the extraction of rosmarinic acid from sage by factorial design of experiments was carried out, starting from 100 mg of plant material with particle size between 310 and 740 micrometers. Dilution of the drug in 10 mL of methanol 40% containing 1 mg/mL ascorbic acid and 10 mM EDTA, sonication for 20 minutes at 45 ° C with subsequent filtration and dilution to injection in chromatographic system were the best conditions established for extraction of the analyte. All samples were analyzed by HPLC on C18 column, eluted with methanol: water (acidified) at 45:55 (v / v) until 5 min. and at 80:20 (v / v) from 5 to 10 min., flow rate of 1 mL / min. and detection at 330 nm. The method was subsequently subjected to validation, from the analysis of specificity, selectivity, linearity, range of application, repeatability, intermediate precision and accuracy parameters. All the values obtained for the analyzed parameters were in accordance with the established by national and international rules, allowing the use of the method for the intended purpose. Evaluation of biological activities was carried out with rosmarinic acid, a fluid extract and an infusion of sage. All were evaluated for toxicity to A. salina nauplii, and the results showed that none of them presented significant toxicity (LC50> 1000 mg / mL). Both rosmarinic acid and sage extracts were also tested for toxicity to B16F10 and McCoy cell lines. McCoy cell cultures were more sensitive, especially at higher concentrations of the treatments. The murine melanoma B16F10 cell line was more resistant to treatment, and concentrations of tests that showed no toxicity to this strain were evaluated for their influence on melanogenesis. B16F10 cells treated for 24 hours with different concentrations of rosmarinic acid and extracts of sage had the concentration of melanin and tyrosinase activity determined. Non-pretreated cell lysates were incubated for 60 min. at 37 °C in the presence of L-DOPA and tests to determine the activity of tyrosinase in vitro. From the experiments we observed that rosmarinic acid has dual effect on melanogenic, being able to increase melanin synthesis and tyrosinase at lower concentrations (10 ìM) and inhibit it at higher concentrations (1000 ìM). This substance was the mainly responsible for the induction of melanin synthesis by fluid extract and infusion of sage in a concentration of 10 ìM. But the extracts did not influence the activity of tyrosinase in the same way that rosmarinic acid, as a result of the actions of other present substances. From this work analytical methods to extract and determine rosmarinic acid were developed, which can facilitate the study of this substance and sage in several areas of scientific research. The knowledge of the biological activities of rosmarinic acid and sage was also expanded, collaborating with future studies of both on the research and development of new drugs and/or herbal medicines for the treatment of pigmentary disorders.