Produção de a-Galactosidase a partir de vinhaça de soja

Abstract

Resumo: A soja é atualmente um dos produtos agrícolas mais abundantes no Brasil, possui alto valor nutricional e é utilizada como alimento tanto para humanos como para animais. Pode ser consumida na forma de óleo, extrato solúvel (leite), farinha, farelo, proteína texturizada e queijo. Além disso, a soja transformou-se em um insumo importante devido às suas propriedades funcionais. Entretanto, o consumo é limitado pela presença de oligossacarídeos que não são digeridos na mucosa intestinal do homem e animais monogástricos, causando distúrbios gastrointestinais como diarréia, náuseas e flatulência. A enzima a-galactosidase hidrolisa as ligações agalactosídicas dos principais oligossacarídeos presentes nos grãos e soja como rafinose e estaquiose. Este trabalho se desenvolveu com o objetivo de otimizar a produção da enzima a-galactosidase e realizar um estudo preliminar de sua purificação, utilizando como substrato a vinhaça de soja, um resíduo resultante da fermentação alcoólica do melaço de soja. O melaço de soja é um subproduto da produção de concentrados protéicos como o farelo de soja. A linhagem Lactobacillus agilis LPB 56 foi selecionada dentre outras nove por apresentar maior atividade enzimática durante a fermentação em vinhaça de soja. A relação C:N do meio de cultivo para o inóculo à base de vinhaça foi otimizada e ajustada em 6:1 com suplementação de extrato de levedura. Esta relação foi determinada através do balanço da composição físico-química do meio. As variáveis no meio de fermentação, concentração de sólidos solúveis (22 a 38°Brix), relação C:N (2:1 a 14:1) e tamanho do inóculo (8 a 42%) foram investigados para otimização da produção da a-galactosidase em fermentação submersa realizada em frascos. Os resultados demonstraram que a concentração de 30°Brix no meio, com a relação C:N de 9:1 e tamanho de inóculo de 25% (v/v) foram as melhores condições para a produção de a-galactosidase. A maior atividade enzimática (11,07 U/mL) foi atingida após 144 h de fermentação em biorreator. Posteriormente, a a-galactosidase foi parcialmente purificada por precipitação com sulfato de amônio, cromatografias de troca iônica e filtração em gel. A fração enzimática parcialmente purificada foi analisada por eletroforese em gel SDS-PAGE. A a-galactosidase apresentou atividade ótima em pH 5,0-5,5 e temperatura de 40°C. A a-galactosidase foi completamente inibida por Hg2+, Cu2+ e Mn2+, e parcialmente inibida por Zn2+, Ag2+ e Ca2+. O valor de KM para hidrólise do pNPG foi de 1,189 mM.

Abstract: Soybean is currently one of the most abundant agricultural products in Brazil, presents high nutritional value and is utilized as food and feed product. It can be consumed in the form of oil, soluble extract (milk), flour, bran, textured soy protein and cheese. Moreover, soybean has become an important raw material due to its functional properties. However, consumption is limited by the presence of oligosaccharides that are not digested in the intestinal mucosa of humans and monogastric animals, causing gastrointestinal disorders like diarrhea, nausea and flatulence. The enzyme a-galactosidase hydrolyzes a-galactosidic bonds of main oligosaccharides presents in soybean as raffinose and stachyose.This work was developed with the aim of optimizing the production of a-galactosidase enzyme and performing its partial purification, using as substrate the soybean vinasse, a residue produced by the alcoholic fermentation of soybean molasses. Soybean molasses is a by-product of the protein-concentrate soybean meal production. The strainLactobacillus agilis LPB 56 was selected among nine for presenting the highest enzymatic activity. The C:N relation of the vinasse-based inoculum medium was optimized and adjusted in 6:1 with yeast extract. This relation was determined from physico-chemical composition medium. The variables soluble solids concentration in the fermentation medium (22 to 38°Brix), C:N relation (2:1 to 14:1) and size of inoculum (8 to 42%) were investigated to optimize the production of a-galactosidase in submerged fermentation in flasks. Results demonstrated that the medium concentration 30°Brix, with a C:N relation 9:1, and size of inoculum 25% (v/v) were the best conditions for a-galactosidase production. The highest enzyme activity (11.07 U/mL) was achieved after 144 h of fermentation in bioreactor. Subsequently a-galactosidase was partially purified by precipitation with ammonium sulfate, ion exchange and gel filtration chromatographies. The partially purified enzymatic fraction was analyzed by electrophoresis in SDS-PAGE gel. a -galactosidase presented optimum activity at pH 5.0-5.5 and temperature 40°C. a-galactosidase was completely inhibited by Hg2+, Cu2+ and Mn2+ and partially inhibited by Zn2+, Ag2+ and Ca2+. The value of KM for the hydrolysis of pNPG was 1.189 mM.