Efeitos do estresse sobre componentes alternativos da cadeia respiratória e na transiçao de permeabilidade em mitocôndrias de tubérculos de batata e caracterizaçao de mitocôndrias de Araucaria angustifolia
Resumo
Mitocôndrias de tubérculos de batata tratados pelo frio foram isoladas com o intuito de comparar os efeitos deste estresse com mitocôndrias de tubérculos não tratados. Este tratamento aumentou a sensibilidade da NADH desidrogenase externa - localizada na face externa da membrana mitocondrial interna - ao mersalil, mas não alterou os efeitos estimulatórios provocados pelo Ca2+. Não foram observados efeitos do mersalil, diamida ou Ca2+ sobre o consumo de O2 quando o substrato era o succinato. A diamida inibiu a oxidação de NADH e succinato em mitocôndrias de batata somente na presença de cianeto, indicando a ação sobre a oxidase alternativa (AOX). Houve inibição da AOX na presença de Ca2+ durante a oxidação de succinato e NADH, mostrando uma possível regulação da enzima pelo íon. O inchamento
mitocondrial induzido por Ca2+ mostrou–se mais evidente após o tratamento dos tubérculos pelo frio. Houve proteção por DTT, EGTA e catalase nas situações de estresse e sem estresse, indicando que grupamentos SH, Ca2+ e espécies reativas de O2 (ERO), estão envolvidos no fenômeno de transição de permeabilidade mitocondrial (TPM) em ambas as situações. O inchamento provocado por Ca2+ e/ou mersalil foi impedido pela presença de SHAM, mesmo em mitocôndrias de tubérculos não estressados, mostrando que o efeito protetor observado não está relacionado com sua capacidade de inibir a AOX e sim, com suas propriedades de quelação aos íons ferro. Neste trabalho também foram isoladas pela primeira vez mitocôndrias de calos de Araucaria angustifolia e assim obtidas mitocôndrias capazes de respirar pela oxidação dos substratos malato / glutamato, NADH e succinato, com alta capacidade fosforilativa, demonstrada pelos controles respiratórios e Dy. Ao contrário das mitocôndrias de batata, mitocôndrias isoladas de calos de Araucaria angustifolia foram capazes de captar Ca2+ de modo sensível ao vermelho de rutênio e dependente do potencial elétrico de membrana e fosfato. Houve também efluxo do ion tanto pelo reverso da via de influxo, pela adição de FCCP, como pela via de efluxo com vermelho de rutênio. Estas mitocôndrias foram capazes de oxidar NADH externamente adicionado na presença de rotenona, e apresentaram um consumo de O2 insensível ao cianeto e sensível ao SHAM, indicando a presença de NADH desidrogenase externa e AOX, respectivamente. Além disso as mitocôndrias foram desacopladas pela presença de ácido graxo e ausência de BSA, sugerindo a presença de proteína desacopladora de plantas, aqui denominada Araucaria- UCP. O estudo destas mitocôndrias capazes de captar Ca2+ e isoladas de uma gimnosperma encontrada principalmente em regiões frias do sul do Brasil permitirá a comparação com mitocôndrias de angiospermas que apresentem ou não o mecanismo de transporte do íon, bem como aprofundar os
conhecimentos em relação a TPM e aos efeitos de estresse pelo frio Mitochondria were isolated from potato tubers exposed to cold
temperature in order to compare the effects of this stress with unstressed tuber
mitochondria. Cold treatment increased the sensitivity of the external NADH
dehydrogenase – located on the external face of the internal membrane – to
mersalyl, but did not alter the stimulatory effects caused by Ca²+. There were no
effects caused by mersalyl, diamide or Ca²+ on the oxygen consumption when
the substrate was succinate. Diamide inhibited the oxidation of NADH and of
succinate in potato mitochondria only when in the presence of cyanide,
indicating an action on the alternative oxidase (AOX). The results showed that
Ca²+ presented an inhibitory effect on the AOX pathway when mitochondria
were energized with NADH or succinate, indicating a possible regulation of the
enzyme by this ion. The mitochondrial swelling induced by Ca²+ was more
evident after cold treatment of the tubers. In stressed and unstressed conditions
there was protection from swelling by DTT, EGTA and catalase.This shows that
thiol reagents, Ca²+ and reactive oxygen species (ROS) are involved in
mitochondrial permeability transition (MPT) under both conditions. Swelling by
Ca²+ and/or mersalyl was delayed when in the presence of SHAM even in
mitochondria from unstressed tubers, which shows that its protective effect is
unrelated to its capacity of inhibiting AOX and probably related to iron quelation.
Mitochondria were also isolated for the first time from callus of Araucaria
angustifolia. The mitochondria obtained were able to oxidize malate/glutamate,
NADH and succinate as respiratory substrates and able to sustain a high
transmembrane electrical potential. Unlike potato mitochondria, those isolated
from callus of A. angustifolia were able to take up Ca²+ supported by substrate
oxidation, sensitive to ruthenium red and dependent on membrane potential and
phosphate. Efflux of Ca²+ by the reversal of the influx pahway occurred by
addition of FCCP and by the efflux pathway by addition of ruthenium red. These
mitochondria were also able to oxidize externally added NADH in the presence
of rotenone, and presented oxygen consumption insensitive to cyanide and
sensitive to SHAM indicating the presence of external NADH-dehydrogenase
and AOX, respectively. Besides, mitochondria were uncoupled, in the absence
of BSA, by the addition of the free fatty acid – oleic acid – thus suggesting the
presence of the plant uncoupling mitochondrial protein, hereby denominated
Araucaria-UCP. The study of these mitochondria capable of Ca²+ uptake,
isolated from a gymnosperm found principally on the highlands of southern
Brazil, will allow the comparison with mitochondria from angiosperms presenting
or not the Ca²+ transporting mechanism. It will also increase our knowledge
regarding MPT and the effects relative to cold stress.
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