Enzimoimunoensaio (ELISA), imunoeletrotransferência (EITB) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), como ferramentas para diagnóstico de fasciolose hepática em bubalinos (Bubalus bubalis Linaeus, 1758)

Abstract

Resumo: No presente trabalho padronizou-se uma técnica de enzimo-imuno-ensaio ELISA indireto para detecção de coproantígenos de Fasciola hepatica LINNAEUS, 1758 nas fezes de Bubalus bubalis Linnaeus, 1758. Num primeiro tempo foram produzidos anticorpos policlonais contra o antígeno de secreção/excreção de Fasciola hepatica em coelhos. Após a padronização, o referido teste foi aplicado a 40 bubalinos, 20 dos quais eram portadores de Fasciola hepatica adultas no fígado (20 exemplares ou mais) e 20 deles negativos. A sensibilidade do teste foi de 95% e a especificidade 100%. O padrão ouro utilizado foi a observação do parasito adulto nos ductos biliares por exame de inspeção em frigorífico e a detecção de ovos do parasito pela técnica dos quatro tamises (GIRÃO e UENO, 1985). A pesquisa de coproantígeno com os anticorpos policlonais quando aplicada em 220 bubalinos procedentes de vários rebanhos, apresentou uma sensibilidade de 68% e uma especificidade de 96%. Compararam-se os perfis eletroforéticos do antígeno de secreção/excreção de Fasciola hepatica do antígeno total de F. hepatica, e de Euritrema coelomaticum GIARD et BILLET, 1892, demonstrando que os mesmos são diferentes. Foi também aplicada a técnica de imunoeletrotransferência com os antígenos totais de Fasciola hepatica e Euritrema coelomaticum, e com extratos de fezes de bubalinos com F. hepatica e bovinos com E. coelomaticum, frente ao anticorpo policlonal (anti-antígeno total e anti-antígeno de secreção/excreção de F. hepatica). A referida técnica permitiu diferenciar tanto os antígenos obtidos dos extratos dos parasitos, quanto os coproantígenos. Utilizando-se de uma técnica de cromatografia líquida de alta eficiência, obtiveram-se os perfis cromatográficos dos extratos totais de F. hepatica, E. coelomaticum e Ascaris summ GOEZE, 1782, os quais revelaram ser diferentes entre si. Pela referida técnica, foram examinados extratos de fezes de seis bubalinos com resultado do teste ELISA positivo e três animais com resultado do teste ELISA negativo, comparando com o padrão o antígeno de secreção/escreção (FhSE) o mesmo perfil cromatográfico foi reconhecido nos animais com pesquisa de coproantígeno positiva e não foi detectado nos animais com pesquisa de coproantígeno negativa, o que demonstra que esta metodologia pode ser aplicada para o diagnóstico da fasciolose hepática.

Abstract: In the current work we standardized an indirect technique of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection antigens of Fasciola hepatica LINNAEUS, 1758, in the feces of Bubalus bubalis LINNAEUS, 1758. Initially, antibodies policlonais against the antigen of the secretion/excretion of Fasciola hepatica in rabbits were developed. Following the standardization, the above test was applied to 40 buffaloes, of wich 20 were carriers of mature Fasciola hepatica in their livers (20 or + liver flukes) and 20 were negative. The sensitivity of this test was 95% and the specificity 100%. The gold standard was observation of the adult parasite in the billiar ducts by examining especimens at the slaughterhouse, and the detection of the parasite ova, by 4 metalic sifters (GIRÃO E UENO, 1985). Research of coproantigens with policlonais antibodies when applied to 220 bubalinos from several herds, demonstrated a 68% sensibility and a 96% especificity. Profiles electroforesis of antigens of secretion/excretion of Fasciola hepatica, of the complete antigen of Fasciola hepatica, of Eutitrema coelomaticum GIARD ET BILLET, 1892 were compared and were determined to be different from one another. Also applied was technique of imunoelectrotransference-blot (EITB) with all antigens obtained from Fasciola hepatica, Euritrema coelomaticum and with extracts of feces from buffaloes with Fasciola hepatica and cattle with Euritrema coelomaticum, relative to the policlonal antibody (total anti-antigen and anti-antigen from the secretion/excretion of Fasciola hepatica). This technique allowed the differenciation of the antigens obtained from the parasites as well as of the coproantigens. Employing a high performance liquid chromatography (HPLC), chromatografic profiles were obtained of Fasciola hepatica, Euritrema coelomaticum e Ascaris suum GOEZE, 1982, wich were shown to be totally different from each other. Using the technique above to analyse the feces extracts of six buffaloes with positive results from the ELISA test and three animals with negative results from the ELISA test, employing as a standard the secretion/excretion antigen (FhSE), the same results was obtained from the ELISA positive animals and not from the ELISA negative animals, which demonstrates this methodology may be applied to diagnose Fasciola hepatica.