Detecção molecular de Giardia sp em amostras fecais e água : extração de DNA genômico, PCR e RFLP

Abstract

Resumo: Os objetivos do presente trabalho foram: padronizar técnica de extração de DNA de cistos de Giardia de humanos e animais; padronizar a técnica de PCR para pesquisa de DNA de Giardia em fezes e em água e caracterizar os genótipos dos isolados de Giardia sp por meio da técnica de RFLP. Foi realizada a caracterização molecular de 98 amostras de cistos de Giardia sendo 69 de humanos, 21 de canídeos e 8 de caprinos. Os cistos foram isolados das fezes por meio da técnica do gradiente de sacarose, lavados e submetidos à extração de DNA. Foram testados seis protocolos para rompimento dos cistos e extração de DNA e o mais eficiente foi o que utilizou ultra-som associado ao protocolo de WEISS,1993. O DNA obtido foi submetido à PCR padronizada para os iniciadores GGL405-433/GGR592-622 específicos para G.duodenalis. Utilizou-se DNA extraído de trofozoítos da cepa Portland-1 (ATCC 30888) como controle positivo e água pura como controle negativo. A PCR revelou três padrões de fragmentos, um com 218pb, outro com 100pb e o terceiro com os dois fragmentos. A aplicação do programa UPGMA aos resultados da PCR agrupou os isolados de G.duodenalis em três grupos. Os produtos obtidos da PCR foram submetidos à RFLP com as enzimas de restrição BspD I, Hae III e Hha I, independentemente. Os dados obtidos da RFLP foram analisados com o programa NTSYS e agrupados pelo programa UPGMA, permitindo a separação dos isolados em quatro grupos, dois deles apresentando uma subdivisão em dois subgrupos.Nos quatro grupos formados não foi possível separar os genótipos por hospedeiro, ou local de procedência dos isolados o que confirma o potencial zoonótico de Giardia duodenalis. Como Giardia é um parasito de veiculação hídrica, foi avaliada a sensibilidade da técnica de PCR aqui padronizada para detecção de cistos em água. Foi feita a contaminação experimental de água com cistos de G.duodenalis nas concentrações de 1 a 105 cistos em volume final de 500 mL. Cada amostra contaminada foi submetida à filtração em membrana Millipore (0,8 µm). Os cistos foram recuperados da membrana e concentrados por centrifugação. Os sedimentos obtidos foram submetidos à extração de DNA e este à PCR padronizada. Amostras de 1 a 1 x 105 cistos que não passaram pelo processo de filtração foram testadas em paralelo. A PCR foi capaz de detectar DNA de um único cisto nas amostras não filtradas e 10 cistos nas amostras submetidas à filtração. Também foi avaliada a eficiência da PCR para detecção de Giardia em água de quatro estações de captação do Estado do Paraná (ETAs). A PCR detectou a presença de DNA de Giardia na água destas quatro estações de captação.

Abstract: The objectives of the present work were: to determine a standard procedure for DNA extraction of Giardia cysts from humans and animals and to provide a standard PCR technique for DNA detection of Giardia from faeces and water, and also to characterise genotypes of the Giardia sp. isolates by RFLP technique. This approach was performed using isolates of G. duodenalis cysts detected from water as well as from faeces samples by utilizing sucrose gradient. A total of 98 samples were analyzed in which 69 were from humans, 21 from dogs and 8 from goats. Six protocols for DNA extraction were tested and the most effective procedure was the use of sonication associated to WEISS (1993) protocol. The obtained DNA was submitted to PCR here standardized using specific primers for G. duodenalis (GGL405-433/GGR592-622). For positive control it was utilized DNA extracted from trophozoites of Portland-1 strain (ATCC 30888), and pure water was used as negative control. Three standard fragments were obtained from PCR, one showed 218bp, other with 100bp and the third one with 2 fragments. UPGMA program was applied to the PCR results and showed isolates of G. duodenalis grouped into three groups. PCR products were also submitted to RFLP methodology using the following, and independently, restriction enzymes: BspD I, Hae III and Hha l. The results obtained from RFLP were then analyzed by NTSYS program and grouped by UPGM program that showed the isolates separation into 4 groups in which two of them have reveled a separation into two subgroups. The separation of the genotypes by host or geographic origin was not possible and this fact confirms the zoonotic potential of Giardia duodenalis. Since giardiasis is a waterborne disease, the sensitivity of PCR technique here standardized was evaluated for cysts detection in water. An experimental water contamination with G. duodenalis cysts was performed with concentration from 1 to 105 in final volume of 500 mL. Each contaminated sample was filtered using Millipore membrane (0.8 µm) and the recovered cysts were concentrated by centrifugation. The obtained sediments were submitted to DNA extraction and afterwards to the standard PCR. In parallel, unfiltered samples from 1 to 1 x 105 cysts were also tested. PCR was able to detect DNA from one cyst from unfiltered samples and 10 cysts from filtered ones. The PCR efficiency to detect Giardia in water from 4 water capitation stations from Paraná State (ETAs) was also evaluated and DNA of Giardia was found in all of them.